復肝口服液中大黃素含量的RP-HPLC法檢測

李耀興

（吉化集團公司總醫院，吉林 吉林 132021）

復肝口服液中大黃素含量的RP-HPLC法檢測

李耀興

（吉化集團公司總醫院，吉林 吉林 132021）

目的 探究復肝口服液中大黃素含量的檢測辦法——反相高效液相色譜法實驗測試。方法 按照以下標準來進行本次試驗，要求色譜柱為 TB-C18 （160mm×513mm，6μm），甲醇 -0.2% 磷酸（80 ∶ 19），檢測波長為 530nm，柱溫為 40℃，流速為 2.0mL/S。結果 大黃素的樣本標準容量為 0.08652-0.12570mg，在這個有限范圍內的函數回歸關系（r=0.8976），平均回收率為 99.36%，RSD=1.021%（n=6）。結論 本文介紹的檢測辦法簡單易操作、快捷、效果良好，符合國家藥品管理復肝口服液的質量標準。

大黃素含量；復肝口服液；反相高效液相色譜法

復肝口服液的主要藥物成分是柴胡、當歸、白芍、茯苓、白術、黃芪、枸杞子、女貞子、菟絲子、何首烏等名貴中草藥，它的功效主要是抗病毒、提高人體免疫力、增強肝腎排毒功能、促進人體吸收消化[1]，在臨床上主要用于治療病毒性乙型肝炎和丙型肝炎。虎杖這一味藥是復肝口服液的主要成分，而大黃素則是虎杖的重要活性組成部分，所以我們選取了大黃素作為檢測復肝口服液是否合格的指標，用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法檢測定大黃素的成分及含量，這個方法方便、快捷、安全系數高，是值得信賴的好產品。

1 實驗資料

為了保障實驗的可靠程度高，收集的數據準確無誤，我們在選用儀器設備上也要精益求精。本次實驗儀器主要是1200型HPLC儀，包括G2170AB型PC化學工作站、G2311A型梯度泵、G2314A型紫外檢測器；AX-200型電子天平；SQ250DD型數控超聲波清洗器。試用藥品是甲醇（色譜純）和重蒸餾水，至于其他的試劑都必須是分析純。所有的實驗所需的物料都已經準備完善了，下面我們會詳細介紹試驗方法和步驟。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜標準

我們嚴格要求色譜柱TB-C18（160mm×513mm，6μm），甲醇-0.2%磷酸（80∶19），檢測波長為530nm，柱溫為40℃，流速為2.0mL/s。此時我們發現，在對照品的曲線圖里大黃素與分色譜線呈現出交叉垂直，而大黃素與樣品中的色譜基線相分離，出現兩個高峰的位置，陰性對照在大黃素色譜峰位置處沒有錯峰出現，保持5min時間。

2.2 溶液試劑的準備

下面我們簡單介紹一下對照品溶液的制作過程：首先取出對照品400mg大黃素，放在300mL的玻璃量杯中，加少量甲醇溶液，手動搖勻稀釋對照品溶液至濃度為19.12μg/mL。

供試品溶液的制備：取出樣品30mL，將其放在60mL圓底燒瓶中，加濃度為2.45mol/L的硫酸15mL，然后加適量的水讓其過濾，濾液移入分液漏斗中，加三氯甲烷萃取20mL/次，一共萃取3次，最后把所有萃取液合攏回收，蒸干萃取液，把剩余的殘渣加入甲醇溶解并轉移到5mL量杯中，搖勻，用0.4μm的微孔過濾膜即得到試驗品溶液。

緊接著我們把陰性對照溶液的制作方法做一下簡單的了解：按照事先計算好的溶液比例和生產制作工藝制備不含虎杖的陰性樣品溶液，必須采用專業的方式方法制備陰性對照溶液，大膽細心的分離出對照品溶液中的大黃素成分，并且按照色譜條件測定高峰面積，還要引用數學中的微積分，進行線性回歸的假設，得出一個線性回歸方程為Y=2321.16536X-3.3452 （r=0.198789）。計算結果表明，峰面積積分值的大小與大黃素樣本容量在0.06785-0.37865mg的范圍內的數學關系出現令人欣慰的線性關系。

精密度試驗：我們吸取對照品溶液10μL，按照以上的色譜標準重復實驗4次，測試后的峰面積的平均積分值為435.649，RSD=0.356%（n=5），這就說明儀器的精密度十分穩定，便于工作人員的操作。

穩定性試驗：我們選擇在第2、4、6、8、10h分別測試相同的一組供試品溶液，我們隨機抽取了10μL樣品溶液，測試結果中的峰面積平均積分值為398.358，RSD=0.98%，我們可以得出的結論是供試品溶液至少在這10h內的化學性質是十分自然和穩固的，不需要實驗人員的額外關注。

重現性試驗：我們選取同一批樣品溶液，按照1∶1的比例進行試供品溶液的集體分發，在5份供試品溶液中我們按照色譜條件的標準來建立測試檔案，結果顯示為大黃素的平均含量為4.231mg/mL，RSD=0.99%，這說明了試樣結果很符合之前的猜想。

加樣回收率試驗：取已知含量的樣品30mL共5份，置于圓底燒瓶中，分別加入對照品溶液17.68μg/mL 4、5、6mL，我們把供試品溶液按上述色譜條件測定后的結論加以整合，得出的樣回收率，具體結果可以見表1。

表1 樣回收率試驗結果（n=8）

樣品含量檢測：我們選擇了3個不同生產批次的復肝口服液，每次隨機抽取20mL，并且按照科學有效的方法制造供試品溶液，取15mL進入樣本溶液，按照上文提到的方式-色譜條件標準法來監測出峰面積，然后根據既定的回歸方程式計算出大黃素的真實含量，最終這3批樣品的綜合含量為5mg/mL（n=4）；RSD的值分別為0.13%、0.19%、0.23%。

3 討 論

我們在探索酸水解精確時間時是這樣做的：取4份樣品溶液，每一份都是30mL，分別放置在50mL圓底燒杯中，然后再往燒杯里添加200mol/L的硫酸15mL，進行水浴回流1、2、3h，過濾后，將濾液用氯仿萃取4次，每次15mL，合并所有的萃取液，降低壓力讓其快速蒸發干凈，最后添加4mL甲醇溶解和過濾，經過短暫的沉靜，就可以用儀器檢測出大黃素的實際含量。結論是酸水解時間分別為第1、2、3h時，對應的樣品含量分別為3245、4067、4213mg/mL，這就說明酸水解1h即可[2]。在研究三氯甲烷需要多少萃取次數時，我們是這樣嘗試的取出樣本溶液4份，每一份都是15mL，分別倒入60mL圓底燒瓶中，增加230mol/L的硫酸15mL，經過1h水浴回流后，過濾，濾液要經過氯仿萃取多次，每次15mL，然后將萃取液降低壓力至完全脫水，加少量甲醇溶解，過濾，提取第4次時，對應的樣品含量分別為4231、432、4150mg/mL，說明提取4次后就已經將大黃素完全提取出來了[3]。在試驗中曾經采用不同長度的C18色譜柱比較分離效果，結果采用TB-C18分離效果是最好的，不僅等待的時間最短，而且大黃素的提取含量也是最高的。在可變波長紫外檢測器上檢測出了很多不同的數據，但是相對集中的數據是245、289、440、429nm這四個波長，在研究相對集中的波短下的樣品圖譜，結果最終選擇430nm作為檢測波長，不僅圖譜的圖形清晰明了，準確度也提高了許多。流動相中這二者的浮動比例進行多次篩選，我們決定選用甲酸-0.11%磷酸，因為在這個比例上大黃素與雜質的分離效果是比較接近實際的。

[1]國家 藥典 委員會 編.中華人民 共和國藥典 (一 部 )[S].北 京:化 學工業出版社,2005:附錄331.

[2]鄭鳳 庚.反 相 高 效 液相色譜 法測定明 珠口服液中 大 黃 素 的 含 量[J].時珍國醫國藥,2001,12(5):3921.

[3]陳 娜 娜.高 效 液相色譜 法測定常通口服液中大 黃 素的含 量[J].中國藥房,2003,14(5):2961.

R927.2

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：1671-8194（2013）10-0077-02