細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子在乳腺導(dǎo)管增生性疾病及乳腺癌中的表達(dá)及意義

武彤彤吳春蓮羅京華黃卓雅楊清緒

（1 惠州市中心人民醫(yī)院病理科，廣東 惠州 516001；2 惠州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣東 惠州 516001）

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子在乳腺導(dǎo)管增生性疾病及乳腺癌中的表達(dá)及意義

武彤彤1吳春蓮1羅京華2黃卓雅1楊清緒1

（1 惠州市中心人民醫(yī)院病理科，廣東 惠州 516001；2 惠州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣東 惠州 516001）

目的 研究共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變蛋白（Ataxia-Telangiectasa mutated protein，ATM protein）、檢測點(diǎn)激酶2（Checkpoints kinase1，Chk2）及P53在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（invasive ductal carcinoma，IDC）、導(dǎo)管內(nèi)癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）、非典型導(dǎo)管增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）、癌旁正常乳腺組織（normal brease tissues adjacent to cancer，NBTAC）中的表達(dá)情況，探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 采用免疫組化S-P法檢測 63例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、39例導(dǎo)管內(nèi)癌、42例非典型導(dǎo)管增生、56例癌旁正常乳腺組織中ATM、Chk2及P53的表達(dá)情況。結(jié)果 ATM、Chk2在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)明顯低于癌旁正常乳腺組織；P53在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常乳腺組織；ATM、Chk2與P53表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論 乳腺浸潤性癌ATM、Chk2表達(dá)缺失及P53的表達(dá)增高可能是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一，聯(lián)合檢測對早期乳腺癌的診斷及判斷乳腺癌預(yù)后有指導(dǎo)意義。

乳腺癌；共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變蛋白（ATM）；檢測點(diǎn)激酶2（Chk2）；P53；免疫組織化學(xué)

乳腺癌是常見的婦科腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著婦女的健康。研究表明癌癥的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果，其中基因突變占有重要地位。本研究將應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白（ATM）、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2（Chk2）及P53在乳腺浸潤性癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、非典型導(dǎo)管增生、癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)情況，它們在乳腺癌中的作用及相互之間的關(guān)系探討其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取我院病理科2006～2010年的乳腺癌患者（均經(jīng)病理證實(shí)為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌）的乳腺活檢組織石蠟包埋標(biāo)本63例，同時選取我院2006～2010年確診的導(dǎo)管內(nèi)癌39例，非典型導(dǎo)管增生42例，癌旁正常組織56例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采取免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），一抗包括鼠源ATM單克隆抗體（美國Zymed公司），兔源Chk2、P53多克隆抗體（美國Zymed公司）。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。免疫組化結(jié)果：ATM、Chk2與P53陽性染色定位于細(xì)胞核，均為出現(xiàn)黃色到棕褐色顆粒。陽性細(xì)胞（10個高倍視野）≤25%計(jì)1分，26%～75%計(jì)2分，≥76%計(jì)3分；陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度按無著色、黃色、棕黃色和棕褐色分別判為0、1、2、3分。根據(jù)兩項(xiàng)積分之和判斷結(jié)果，0分為陰性（-），1—2分為弱陽性（+），3-4分為中度陽性（++），5-6分為強(qiáng)陽性（+++）。+視為低表達(dá)，++、+++視為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS（10.0 for window）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用χ2檢驗(yàn)、非參數(shù)Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 ATM、Chk2及P53的表達(dá)情況在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）、導(dǎo)管內(nèi)癌（DCIS）、非典型導(dǎo)管增生（ADH）、癌旁正常組織（NBTAL）中表達(dá)及陽性率（表1）。ATM（圖1）、Chk2及P53（圖2）陽性信號呈黃色到棕黃色顆粒狀。

表1 ATM、Chk2與P53蛋白表達(dá)情況

2.2 ATM、Chk2及P53表達(dá)結(jié)果 ⑴ATM、Chk2蛋白的表達(dá)結(jié)果。在浸潤性導(dǎo)管癌的陽性率分別為57.1%、55.6%，明顯低于癌旁正常組織76.7%、73.2%，兩種之間存在顯著差異（P＜0.05）；在浸潤性導(dǎo)管癌的陽性率分別為57.1%、55.6%，在導(dǎo)管內(nèi)癌的陽性率分別為61.5%、58.9%，在非典型導(dǎo)管增生的陽性率分別為61.9%、59.5%，浸潤性導(dǎo)管癌與導(dǎo)管內(nèi)癌之間，浸潤性導(dǎo)管癌與非低典型導(dǎo)管增生之間均是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。⑵P53蛋白的表達(dá)結(jié)果 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的陽性率為49.2%，在導(dǎo)管內(nèi)癌的陽性率為28.2%，在非典型導(dǎo)管增生的陽性率為30.9%，在癌旁正常乳腺組織中陽性率為10.7%；在浸潤性導(dǎo)管癌與癌旁正常組織之間、浸潤性導(dǎo)管癌與導(dǎo)管內(nèi)癌之間、導(dǎo)管內(nèi)癌與癌旁正常組織之間、非典型導(dǎo)管增生與癌旁正常組織之間均存在顯著差異（P＜0.05）。⑶在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌中的P53與ATM、Chk2表達(dá)之間存在顯著負(fù)相關(guān)。

圖1 ATM在癌旁正常乳腺組織中導(dǎo)管上皮陽性表達(dá)（SP法，×100）

圖2 P53在浸潤性導(dǎo)管癌中癌組織陽性表達(dá)（SP法，×100）

3 討 論

共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變蛋白（Ataxia-Telangiectasia mutated protein，ATM protein），為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，含有3056個氨基酸殘基，是一種大分子量蛋白，相對分子質(zhì)量約為370×103[1]。ATM蛋白激酶是一種自動磷酸化蛋白，分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以細(xì)胞核為主，在高等真核生物體組織細(xì)胞內(nèi)普遍存在，一些組織細(xì)胞如睪丸、脾臟、胸腺等組織內(nèi)高表達(dá)。通常情況下，ATM蛋白激酶以無活性的二聚體形式存在。

ATM蛋白激酶在維護(hù)整個基因組的穩(wěn)定性中充當(dāng)重要的角色。應(yīng)對DNA損傷物，ATM激活不同的效應(yīng)底物，發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡等作用。ATM蛋白激酶是DNA損傷修復(fù)過程的關(guān)鍵調(diào)控者，它主要參與：①激活細(xì)胞周期檢測點(diǎn)。ATM蛋白激酶參與DNA損傷后，激活多個復(fù)雜的細(xì)胞周期檢測點(diǎn)，包括：G1/S檢測點(diǎn)、S期檢測點(diǎn)、G2/M檢測點(diǎn)[2]。其信號通路有兩條：一條激活Chk1，Chk1引起CDC25的Ser216磷酸化，通過抑制CDC25的活性，抑制M-CDK的活性，細(xì)胞周期中斷；另一條是激活Chk2[3]，使抑癌基因P53被磷酸化而激活。這些活化的P53、Chk2等參與抑制磷酸化Tyr-15位點(diǎn)的脫磷酸化有關(guān)，最終使細(xì)胞不能通過檢查點(diǎn)“關(guān)卡”而導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯。Squatrito[8]等通過對小鼠腦膠質(zhì)瘤模型研究，發(fā)現(xiàn)ATM/Chk2/P53通路成分異常能抑制腫瘤的形成和增加腫瘤對放射線的抵抗性。②DNA的修復(fù)。ATM蛋白激酶監(jiān)視DNA的損傷并且通過磷酸化激活相關(guān)的蛋白，調(diào)節(jié)眾多方面的DNA損失應(yīng)答過程[4、11]。當(dāng)ATM蛋白激酶發(fā)生突變、失活和功能受損后，細(xì)胞缺乏功能正常的ATM蛋白激酶，不能正常修復(fù)受損的DNA，受損的DNA很容易隨細(xì)胞分裂而傳人子細(xì)胞，最終易導(dǎo)致癌變。③參與細(xì)胞凋亡。ATM蛋白激酶可以通過調(diào)節(jié)DNA損失與死亡受體信號傳遞之間的相互作用介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。

Chk2是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，有一定的底物特異性。Chk2是ATM的作用靶點(diǎn)，在DNA損傷后，ATM識別損失信號，繼而使Chk2獲得充分的活性，應(yīng)對各種原因造成的DNA的損傷[7]。

研究表明在正常乳腺組織的上皮中，ATM蛋白激酶只表達(dá)導(dǎo)管上皮分泌細(xì)胞，而肌上皮細(xì)胞幾乎不表達(dá)。而在30%～50%的浸潤性乳腺癌腫瘤細(xì)胞中ATM表達(dá)下降或缺失[5]。ATM與Chk2在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控細(xì)胞周期的功能一致[6]。在本研究中，ATM、Chk2在乳腺浸潤性癌中的表達(dá)明顯低于正常組織。

DNA損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡必須要P53的參加，P53基因突變是目前所知人體腫瘤中最常見的基因改變。P53基因突變后不僅喪失抑癌功能，而且具有癌基因的特征。而免疫組化檢測到的是以突變型為主的P53蛋白。在本研究中，P53在在乳腺浸潤性癌中的表達(dá)明顯高于正常組織。P53在正常乳腺組織中的表達(dá)明顯低于導(dǎo)管內(nèi)癌，而導(dǎo)管內(nèi)癌中的表達(dá)低于乳腺浸潤性癌。P53與ATM、Chk2表達(dá)之間存在顯著負(fù)相關(guān)[10]。

綜上，ATM蛋白激酶、Chk2、P53的表達(dá)及相互之間的關(guān)系，它們在乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展中的作用，還有待于進(jìn)一步的研究與探索，還需要進(jìn)一步加大樣本量，而且對某些技術(shù)與方法的應(yīng)用也有待于進(jìn)一步的改善、改進(jìn)和建立。ATM蛋白激酶表達(dá)或活性改變涉及了腫瘤的發(fā)生，并影響腫瘤的治療及預(yù)后，提示ATM蛋白激酶或許能成為腫瘤治療過程中一個新的作用靶點(diǎn)，為腫瘤治療開辟更廣闊的空間。

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Expression and Significance of Cell Cycle Regulators in Breast Intraductal Proliferative Diseases and Breast Carcinoma

WU Tong-tong1, WU Chun-lian1, LUO Jing-hua2,HUANG Zhuo-ya1,YANG Qing-xu1
(1 Department of Pathology, Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou 516001, China; 2 Department of Pharmacy, Huizhou Central Hospital, Huizhou 516001, China)

Objective This study investigate the expression of cell cycle regulators , including ATM、Chk2 and p53 in breast carcinoma. Methods The expressions of ATM、Chk2 and p53 in 63 cases of breast invasive ductal carcinoma (BIDC)、39 cases of breast carcinoma in situ (BIDC)、42 cases of atypical ductal hyperplasia (ADH) and 56 cases of normal breast tissues adjacent to cancer (NBTAC) were observes by SP immunohistochemistry. Results The positive expression levels of ATM and Chk2 in BIDC were significantly lower than NBTAC (P＜0.05). The positive expression level of P53 in BIDC was significantly higher than NBTAC (P＜0.05). Conclusion These results suggest that down-regulation of ATM and Chk2, and over-expression of P53 are significantly related to genesis and progression of breast carcinoma. Combined determination of these three proteins may play an important role in diagnosis and prognosis of breast carcinoma.

R737.9

B

1671-8194（2013）19-0001-02

惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：20110807）