酶解藍圓鲹蛋白制備降血壓肽的工藝研究

舒 冰,孫建華,伍善廣,趙鐘興,廖丹葵

(廣西大學 化學化工學院,廣西 南寧 530004)

血管緊張素轉化酶(angiotension converting enzyme,ACE)在人體血壓調節過程中起重要的生理作用,它可以催化血管緊張素I轉化為具有最強血管收縮作用的血管緊張素Ⅱ并使腎素失去催化活性使血壓升高,而高血壓是引發心血管疾病造成動脈硬化及心肌梗塞的主要危害因素之一[1],因此治療和預防高血壓病是當今社會十分重要的課題。而血管緊張素轉化酶抑制劑具有抑制ACE活性的作用,因此ACE被認為是控制高血壓的最有效的方法之一。

自1977年開發設計了化學合成的ACE抑制劑卡托普利以來,人工合成的ACE抑制劑已得到醫學界的普遍認可。然而,人工合成ACE抑制劑在臨床應用過程中往往會產生如咳嗽等副作用[1]。因此,尋找天然、安全的食物來源的ACE抑制劑來預防和治療高血壓引起了廣大科學工作者的極大關注,食物蛋白源 ACE抑制肽即是這樣一類降血壓功能因子,由于酶解法具有生產安全性高、能在溫和的條件下進行定位水解分裂產生大量的短肽,生產時間短,水解過程易控制,價廉易于推廣的優點,因此該法應用較為普遍。研究表明,很多源于食物源蛋白如酪蛋白[2]、乳清蛋白[3]、大豆蛋白[4]、谷物蛋白[5]及魚蛋白[6]等水解物中已經陸續分離得到很多天然的ACE抑制劑。

藍圓 鲹作為一種低值海洋魚類,其形體小、產量大、營養豐富,有很大的開發價值。但由于缺少有效的加工方法而大都被加工成飼料、魚糜和休閑食品等,導致產品附加值低,蛋白質資源沒有充分利用[7,8]。

本文以藍圓 鲹(Decapterus maruadsi)魚肉蛋白為原料,選用 6種蛋白酶在各自適宜的條件下酶解制備藍圓 鲹降血壓肽,并采用超濾技術對酶解產物中活性組分進行初步分離富集,為開發新的生物活性肽,提高藍圓 鲹 蛋白質的利用率以及為藍圓 鲹的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)及血管緊張素轉化酶(ACE)購自Sigma公司等。堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶由南寧龐博生物技術公司提供;其他化學試劑為國產色譜純或分析純;鲹藍圓 購于廣西北海魚市批發市場。

A-88型組織搗碎勻漿機,江蘇金壇市醫療儀器廠;4K15型低溫高速離心機,Sigma公司;Aglient 1100高效液相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司;Labscale 小型切向流儀,美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解工藝

將冷凍的藍圓 鲹解凍后去頭尾、骨架后勻漿,將勻漿液于75℃條件下干燥后,再將其粉碎,過20目篩后測定魚粉蛋白質含量。取含一定質量蛋白質的魚粉,按料水比混合后煮沸 15 min,冷卻至酶解溫度并調至酶解 pH,加入一定量的酶啟動反應。在恒溫下不斷加入堿或酸溶液以維持體系pH恒定,酶解結束后調pH至中性,煮沸10 min將酶滅活,將酶解產物在4 ℃、6 000 r/min的條件下離心10 min,取上清液備用。

1.2.2 水解度(DH)的測定

水解度的測定,采用pH-stat滴定法[9]。

1.2.3 活性反應液的制備與檢測

參考Cushman等的檢測原理,采用HPLC法檢測樣品的體外抑制活性[10]。

1.2.4 酶解條件優化

以木瓜蛋白酶和藍圓 鲹蛋白為原料進行酶解,分別考察酶用量、酶解溫度、pH值及底物濃度對水解度和抑制率的影響。

1.2.5 降血壓肽的初步分離

選用10 kDa和5 kDa的超濾膜對酶解液進行初步分離,測定分離后不同組分對ACE的抑制活性及各濾液蛋白回收率。

2 實驗結果與分析

2.1 不同酶解產物的活性

選用6 種蛋白酶對藍圓 鲹蛋白進行酶解,相同質量酶解產物對ACE的抑制效果如圖1所示。

由圖1可知各種蛋白酶的酶解產物對ACE均有抑制作用,其中木瓜蛋白酶酶解產物對ACE的抑制效果較理想,堿性蛋白酶的酶解產物對ACE的抑制效果最小,這在酶解其他蛋白質制備降血壓肽的研究中也有類似結果[11-12],說明藍圓 鲹蛋白經上述 6種蛋白酶酶解后均可產生具有抑制ACE活性的片段,但由于酶的專一性不同,使得產生的肽片段種類和數量存在差異,導致酶解產物對ACE的抑制效果相差較大,因此選用木瓜蛋白酶為制備藍圓 鲹降血壓肽的酶解用酶。

圖1 6種蛋白酶酶解產物的抑制活性Fig.1 The ACE inhibitory activity of six kinds of hydrolysates

2.2 木瓜蛋白酶酶解藍圓 鲹蛋白工藝優化

2.2.1 水解度(DH)與抑制率(IP)的關系

藍圓 鲹蛋白在不同水解度下的酶解產物對 ACE抑制效果如圖2所示。

圖2 水解度與抑制率的關系Fig.2 The diversification for DH and ACE inhibitory ratio

由圖 2知,隨著藍圓鲹蛋白酶解時間的延長,水解度逐漸增大,酶解產物對ACE的抑制率隨水解度的增加而增大,在水解度為13.7%時達到最大,隨后水解產物對ACE的抑制率呈降低趨勢,可能是由于水解初始階段生成的具有ACE抑制活性的肽增加,表現為隨水解度的增大,酶解產物對 ACE的抑制活性增強,隨著水解的繼續進行,具有ACE抑制活性的肽被進一步水解成無活性或活性較小的短肽或氨基酸,從而表現出總體對ACE的抑制活性降低[13],并且蛋白肽的水解度與其對ACE抑制率沒有嚴格的相關性,即水解度高抑制活性不一定高[14]。為確保酶解產物具有較好的ACE抑制活性,確定本實驗的水解度應控制在13.0%～16.0%之間,酶解時間不超過240 min。

2.2.2 初始酶用量對水解度的影響

在初始底物濃度為20 g/L,溫度為55 ℃,pH為7.0,水解時間為 4 h的條件下,改變初始酶加入量,水解度隨酶用量的變化如圖3所示。

圖3 酶用量對水解度的影響Fig.3 Effect of different initial enzyme concentrations on DH

由圖3可知,在酶用量較低時,DH隨著酶用量的增加而增大,這是因為在底物濃度一定時增加酶用量,能有更多的酶活性位點與底物結合,反應速率增加,當酶用量增加到7 000 U/g時水解度增加的速度變緩慢,此時底物與酶的結合幾乎已經達到飽和狀態,部分酶不能與底物結合,因此,酶解工藝中初始酶用量選擇為7 000 U/g。

2.2.3 初始底物濃度對水解度的影響

在初始酶用量為7 000 U/g,溫度為55 ℃,pH為7.0,水解時間為4 h條件下,考察初始底物濃度對水解度的影響,結果如圖4所示。

由圖4知,DH隨底物濃度增大而減小,是由于在酶用量一定時,底物濃度增加溶液黏度增大,使得酶的擴散和傳質受到影響, 而當底物濃度增大到30 g/L時,在固定時間內達不到高抑制率要求的水解度范圍,因此選擇初始底物濃度為25 g/L。

2.2.4 溫度對水解度的影響

在初始酶用量為7 000 U/g,底物濃度為25 g/L,pH為7.0,水解時間為4 h條件下,不同酶解溫度對水解度的影響如圖5所示。

圖4 底物濃度對水解度的影響Fig.4 Effect of different initial substrate concentrations on DH

圖5 溫度對水解度的影響Fig.5 Effect of different temperatures on DH

溫度對酶促反應速度的影響是溫度上升時,反應速度加快,隨著溫度的升高,酶活性開始受到抑制,催化速度開始下降[15]。由圖5知,酶在45℃水解度較其他溫度的水解度高,為使酶作用保持高效率則選擇45℃為酶解溫度。

2.2.5 pH對水解度的影響

在酶用量為7 000 U/g,底物濃度為25 g/L,溫度為45 ℃的條件下,考察pH對水解度的影響。結果如圖6所示。

不同pH值不僅可以改變酶的空間構象,使酶發生可逆或不可逆失活,亦可改變底物的解離狀態,影響酶分子活性部位上有關基團的解離,從而影響底物與酶的結合,同時,pH可決定維持酶空間結構的有關基團的解離,影響酶活性部位的構象,進而影響酶活性[15]。圖6顯示,在pH偏酸性時酶的水解度較大,隨著 pH的增大,水解度降低,為方便后續工藝中的除鹽步驟,所以選擇酶解pH為7.0。

圖6 pH對水解度的影響Fig.6 Effect of different pH values on DH

2.3 超濾前后多肽回收率及抑制活性

取蛋白質濃度為 22.4 mg/L的酶解液 500 mL,在 pH為 7.0的室溫條件下,分別選用 10 kDa 和 5 kDa的超濾膜超濾至截流液不大于50 mL,測定超濾前后各部分濾液的 ACE抑制活性及蛋白質回收率,結果如表1所示。

表1 超濾后不同部分濾液的ACE抑制活性Tab.1 ACE Inhibitory activity of different ultrafiltrating solutions

由表1可知,酶解液經10 kDa和5 kDa濾膜超濾后均可實現對酶解產物中活性組分的分離富集。其中,5 kDa滲透液中活性成分對ACE的抑制率可高達88.47%,較酶解液活性提高了1.72倍,而已有研究表明,大多數ACE抑制肽由 2～12個氨基酸組成,個別由 15個氨基酸組成[16],其分子質量范圍約3kDa以下,故用 5 kDa的超濾膜分離是合適的,且該結果與目前很多超濾能夠有效富集降血壓肽活性部分的研究結論相似[17,18]。由此可見,活性組分主要由分子質量小于 5 kDa的肽組成,可通過超濾將酶解液中活性較高的部分進行有效富集。

3 結論

(1)比較了 6 種蛋白酶酶解藍圓 鲹魚肉蛋白的酶解產物對ACE的抑制活性,其中木瓜蛋白酶酶解產物對ACE的抑制活性最大。考察了木瓜蛋白酶酶解藍圓 鲹魚肉蛋白水解度與抑制率的關系,確定水解度在13.0%～16.0%之間酶解產物具有較好的ACE抑制活性,當水解度為 13.7%時酶解產物的 ACE抑制活性最高為67.4%。

(2)考察了初始酶用量、初始底物濃度、酶解溫度以及pH值對水解度的影響,確定了適宜的水解條件為: 初始酶用量為7 000 U/g,初始底物濃度為25 g/L,酶解溫度為 45℃,pH為 7.0,酶解時間為 240 min,此時水解度為16.0%,酶解產物對ACE具有較好的抑制活性。

(3)利用超濾對酶解產物中活性組分進行初步分離和富集,表明產物中高活性組分主要富集于 10 kDa和5 kDa的滲透液中,而5 kDa滲透液中活性成分對ACE的抑制率最高可達88.47%,說明酶解液中活性組分主要由分子量小于5 kDa的肽組成。

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