4株瓊膠降解菌的分離、鑒定及產酶條件分析

牟宗娟,李貴陽,茅云翔,孔凡娜,莫照蘭

(1.中國海洋大學 海洋生命學院,山東 青島 266003;2.中國水產科學院 黃海水產研究所,海水養殖生物疾病控制與分子病理學實驗室,山東 青島 266071;3.中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室,山東 青島 266071)

瓊膠酶能水解瓊膠多糖產生具有多種生理活性的瓊膠寡糖,廣泛應用于醫藥、食品、化工領域。瓊膠酶在生物學領域也有重要的用途,用于制備海藻單細胞和原生質體、回收DNA、研究海藻細胞壁多糖組成和結構等[1]。瓊膠酶分為 α-瓊膠酶(EC3.2.1)和 β-瓊膠酶(EC3.2.1.81)兩類,來源于海洋、淡水和陸地土壤微生物。不同種屬細菌、同種細菌不同菌株甚至同株細菌可以產生不同的瓊膠酶,其降解產物也有不同。如從假單胞菌和交替單胞菌產生的β-瓊膠酶,降解產物分別為新瓊二糖[2]和新瓊四糖[3];假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas sp.)細菌 CY24產生兩種β-瓊膠酶,其降解產物不同[4-5]。海洋細菌是產生瓊膠酶的主要來源,海洋生態環境的多樣性造就了海洋細菌的多樣性,目前發現海洋細菌產生的瓊膠酶在分子結構、大小、底物特異性和催化活性等方面都有獨特的功能[1]。本研究擬從多種海藻和刺參中分離、篩選、鑒定瓊膠降解細菌,優化高效產酶的培養條件,為了解瓊膠酶降解菌多樣性、發現新型瓊膠酶打下基礎。

1 材料與方法

1.1 瓊膠降解菌的分離和篩選

將從青島各海邊采集的腐爛紫菜、海帶、江蘺和從煙臺東方海洋公司收集的刺參腸道分別放入無菌研缽中充分研磨勻漿,用無菌海水稀釋勻漿液,取合適稀釋度的勻漿液涂布于 2216E海水固體培養基上,于 28℃培養觀察一周。挑取周圍出現明顯凹陷的菌落,在2216E海水平板劃線純化兩次,得到的菌株在平板培養48 h后用Lugols碘液染色觀察其菌落周圍產生水解透明圈的情況。取產生明顯透明圈的菌株保存于–80℃冰箱。

1.2 瓊膠酶活力的測定

1.2.1 粗酶液的制備

取細菌單菌落接入 2216E液體培養基培養過夜后,按5%接種量轉接到新鮮的100 mL2216E液體培養基內,于28℃、搖速120 r/min培養一定時間,測定OD540后,取10 mL培養液在4℃、6 000 r/min離心20 min,收集上清液用于細菌胞外酶酶活測定。收集細胞沉淀測定濕質量后,懸浮于 10 mL PBS(pH7.4,0.2 mol),在冰浴條件下超聲破碎細胞: 200 W破碎3次,每次破碎時間10 s,間隔時間10 s ,細胞破碎液經4℃、12 000 r/min離心20 min,收集上清液用于胞內酶酶活的測定[6]。另取10 mL細菌培養液直接超聲破碎、離心,上清用于總酶活的測定。每個實驗重復3次。

1.2.2 瓊膠酶活力測定

采用 DNS測定還原糖的方法測定瓊膠酶酶活[7]。用D-半乳糖為標準品制作標準曲線。1 mL粗酶液與1 mL 0.3%的瓊脂底物溶液(用pH 7.4,0.2 mol的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制)混合,40℃反應 30 min后,加入1.5 mL DNS,煮沸5 min,加入蒸餾水定容至25 mL,在520 nm處測定還原糖吸收值。在上述反應條件下,每分鐘產生l g還原糖所需的酶量作為一個酶活力單位。相對酶活力為每mg細菌濕重產生的酶活力單位。

1.3 產酶條件的優化

1.3.1 最適培養基的選擇

比較分離菌株在 2216E海水培養基,分離培養基[8],發酵培養基[9]的生長情況。

分離培養基: 瓊脂 1.3 g,NaCl 2.5 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,NaNO30.2 g,K2HPO41.0 g,FeSO4·7H2O 0.002 g,CaCl20.02 g,蒸餾水 100 mL,pH 7.5;發酵培養基: 瓊脂 1.3 g,NaCl 2.5 g,蛋白胨 0.5 g,酵母膏 1 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,蒸餾水100 mL,pH 7.5。

取細菌單菌落分別接入上述液體培養基培養過夜后,按5%接種量轉接100 mL相應液體培養基,在28℃、搖速120 r/min條件下培養,在24、36、48、72 h測定菌懸液的 OD540、細菌質量及相對酶活力,根據相對酶活力大小確定最適培養基及最適培養時間。

1.3.2 最適培養條件的選擇

利用1.3.1得到的最適培養基和培養條件,在28℃、搖速120 r/min條件下,進一步優化培養溫度、初始pH和瓊膠底物濃度。設置的培養溫度為15℃、20℃、28℃、37℃,pH為5、7.5、9,培養基瓊脂質量分數為0.1%、0.3%、0.5%、1%。在上述培養條件下測定各菌株的相對酶活力。

1.4 菌株鑒定

按常規方法對細菌進行革蘭氏染色和形態觀察,用API ID-32E試劑條(生物-梅里埃,法國)進行生理生化指標檢測,根據伯杰氏細菌鑒定手冊確定細菌的分類地位;按文獻方法進行細菌16SrDNA序列擴增和序列比對分析[10]。利用軟件Clustal X(V2.0)進行序列完全比對,比對參數中Output Files選項中選擇NEXUS format。利用Mrmodeltest3.7估計核酸最優取代模型,應用于BI的構建。利用MrBayes3.1.2,采用GTR+I+G模型,構建貝葉斯樹[11]。綜合生理生化、16SrDNA序列比對聚類分析結果綜合鑒定細菌。

1.5 瓊膠酶基因的克隆和分析

根據文獻設計 PCR引物擴增細菌瓊膠酶基因agaB[12],正向引物 agaB-for: 5'-ccacttagcactagagcccgtaa-3',反向引物agaB-rev: 5'-tgtacctagcagattgcactccc-3'。在25 μL的PCR反應體系中含有: 10×PCR buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol)各 1 μL,引物(10 μmol)各 1 μL, Taq DNA 聚合酶(5U/UL)0.5μL,DNA 模板 1 μL。PCR 反應條件為: 95℃預變性4 min;94℃變性30 s,45℃復性45 s,72℃延伸3 min,30個循環;72℃溫育10 min。用MEGA4軟件建樹分析。

1.6 數據分析

利用SPSS軟件分析各組數據的平均值、顯著性等。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選以及菌落形態觀察

利用 2216E海水固體培養基從腐爛藻體以及刺參腸道內篩選到多株具有降解瓊膠能力的菌株,可觀察到在菌落處形成明顯的凹陷,隨培養時間延長,菌落周圍出現可辨的透明圈。用Lugols碘液覆蓋菌落周邊區域,被降解的瓊膠不能與碘著色而呈明顯的透明區(圖 1,A),未降解瓊膠與碘結合呈棕褐色(圖1,B)。根據培養48 h后菌落產生的透明圈半徑初步判斷酶活力大小,分別從紫菜、海帶、江蘺、刺參腸道內篩選到 4株產瓊膠酶酶活力最高的菌株,編號分別為QJ、HD、JL和HS,其透明圈半徑(不包括菌落半徑)大小均在0.7～0.8 cm。

在2216E平板上,HD、JL和HS菌株生長較快,24 h即可長出半徑0.1～0.3 cm的菌落,可觀察到菌落周圍有明顯的透明圈,48 h后菌落處瓊膠出現凹陷,一周后平板瓊膠完全分解、液化。QJ菌株在2216E的生長較緩慢,培養36 h的菌落半徑約為0.1 cm,但可觀察到菌落周圍產生明顯凹陷或透明圈,培養過程中未出現平板液化現象。

圖1 用盧戈氏碘液染色的細菌平板Fig.1 Bacterial cultures stained with Lugol iodine

2.2 最佳產酶條件的確定

2.2.1 最適培養基的確定

將4株菌分別在液體的2216E海水培養基、分離培養基、發酵培養基中搖床培養,測定 24、36、48和72 h的OD540值以及相對酶活力。結果如圖2所示,4株菌在3種培養基生長36 h的OD540值最大(P＜0.05),相對酶活力最高 (P＜0.05);4株菌在2216E培養基上生長最好,在36 h的相對酶活力在80 U/mg以上。結果還顯示,菌株QJ在3種培養基的OD540低于其他3株菌,在發酵培養基中基本不生長;在靜置培養時,4株細菌易形成菌膜,在搖床培養時有絮狀出現。

結果表明,4株菌最適產酶培養基為2216E海水培養基,產酶最適培養時間為36 h。

圖2 瓊膠降解菌在3種培養基的相對酶活和OD540Fig.2 The relative enzymatic activities and OD540values of the agarase-producing bacteria cultured in three different media

2.2.2 其他培養條件的優化

以 2216E液體培養基為基本培養基,120 r/min搖速培養細菌 36 h,確定培養溫度、pH、瓊膠底物濃度對細菌產酶的影響。如圖 3所示,培養溫度為28℃時,4株菌顯示最高相對酶活(P＜0.05)。培養基起始pH為7.5時,4株菌的相對酶活最高;除JL和HD在 pH7.5的相對酶活與 pH5.0時的相比有顯著差異外(P＜0.05),其他無明顯差異(P＞0.05)。培養基瓊膠濃度為0.30%時,4株菌的相對酶活最高,除HD、JL、HS在0.30%瓊膠的酶活與0.50%的酶活相比差異不顯著外,其他均呈顯著差異(P＜0.05)。

綜合上述結果,4株菌產酶的最佳培養條件:2216E液體培養基為基本培養基,培養基起始pH7.5,瓊膠底物濃度0.30%,培養溫度28℃,120 r/min搖床,培養時間36 h。

圖3 細菌在不同溫度、pH、底物濃度培養36 h的相對酶活力Fig.3 The relative enzymatic activities under different temperature,pH and substrate concentrations for 36 h

2.3 細菌細胞產酶部位的確定

制備 4株細菌胞外酶和胞內酶的粗酶液,測定酶活并比較大小。結果如圖4所示,在4株細菌的細胞外檢測到的相對酶活力顯著高于胞內相對酶活力(P＜0.01),胞外酶活占總酶活的90%以上。

2.4 瓊膠降解菌菌株的鑒定

4株瓊膠降解菌均為G-,菌落光滑、圓形、白色或奶油色。電鏡下HD、JL和HS菌株的細菌形態為直或彎短桿狀,有周生纖毛;QJ為長桿狀,無周生或極生鞭毛。16SrDNA基因序列相似性比較結果顯示,菌株HD、JL和HS與白色噬瓊膠菌最相似,相似性均達到98%,QJ與Simiduia sp.、糖噬胞菌屬和船蛆桿菌屬最相似,相似性分別為94%、94%、93%。HD、JL、QJ、HS的 16SrDNA基因序列登錄號為JX070038-JX070041。16SrDNA基因序列的聚類分析顯示,HD、JL、HS與白色噬瓊膠菌屬聚為一類,QJ與糖噬胞菌屬、船蛆桿菌屬、假單胞菌屬、海微菌屬(Marinimicrobium sp.)等聚為一簇,但形成一個獨立的分支(圖5)。生理生化反應指標顯示,菌株HD、JL和HS的生理生化反應指標一致,與文獻描述的白色噬瓊膠菌的特征相近;菌株QJ與 Simiduia sp.、糖噬胞菌屬、船蛆桿菌屬的特征有不同(表1)。綜合生理生化特征和16SrDNA基因序列分析結果,將HD、JL和HS鑒定為白色噬瓊膠菌;菌株QJ的分類地位待定。

2.5 瓊膠酶基因的克隆

從JL、HD和HS基因組DNA擴增得到β-瓊膠酶基因(登錄號為 JX070035-JX070037),均含有一個2868bp的閱讀框,三者之間的相似性達到98%～99%,與白色噬瓊膠菌屬和弧菌屬菌株的 β-瓊膠酶蛋白質序列相似性為 98%～99%,相關序列聚類分析如圖 6所示。

3 討論

本研究利用瓊膠作為碳源,從青島海域的腐爛海帶、紫菜、江蘺和煙臺的養殖刺參中分離到多株瓊膠降解菌,經過比較菌落降解瓊膠產生的凹陷直徑大小,得到 4株具有較高瓊膠降解能力的瓊膠降解菌并進行了發酵條件的優化。目前多數的研究以含有較高蛋白胨和酵母膏的發酵培養基來培養瓊膠降解菌,以獲得高酶量[9],本研究結果表明以寡營養的 2216E培養基就能獲得較高的酶量,可以減少培養成本。

圖4 4株菌胞內外酶活的比較Fig.4 Comparison of intracellular and extracellular enzymes activities in the 4 strains

圖5 瓊膠降解菌的系統發育樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis diagram of the agarase-producing bacteria

圖6 瓊膠酶基因的系統發育樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis diagram of the agarase genes

表1 4株瓊膠降解菌及相關菌株生理生化性狀Tab.1 Comparison of the physiological and biochemical characteristics between the agarase-producing bacteria and the other relative bacterial species

續表

細菌鑒定結果表明,菌株HD、JL和HS為白色噬瓊膠菌,與一些學者的研究結果一致[13-16]。已從白色噬瓊膠菌屬分離純化到胞外β-瓊膠酶,其降解產物有的為新瓊二糖[15,17]、有的為新瓊四糖、六糖組成的瓊膠寡糖[16,18];理化性質也有所不同,如 Long等[18]發現一種新的β-瓊膠酶在較廣的 pH范圍內保持較高的活性。本研究從HD、JL和HS擴增得到β-瓊膠酶基因,這些酶的特性有待進一步確定。

從紫菜分離得到的 QJ菌株的分類地位與Simiduia sp.、糖噬胞菌屬、船蛆桿菌屬等的親緣關系較近,這些屬的細菌都具有分解復雜多糖的特性,如船蛆桿菌能分解纖維素[19],Simiduia agarivorans能降解瓊脂[20-21],糖噬胞菌屬能分解多種復雜多糖,如褐藻膠、幾丁質、海帶多糖、淀粉、木聚糖等[21]。QJ菌株的生理生化特征與這些細菌有所不同,其分類地位需要進一步確定。

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