依達拉奉對糖尿病大鼠局灶性腦缺血的神經保護作用

吳 昊

（南召縣人民醫院，河南 南召 474650）

依達拉奉對糖尿病大鼠局灶性腦缺血的神經保護作用

吳 昊

（南召縣人民醫院，河南 南召 474650）

目的 糖尿病是一種代謝性疾病，各種器官的結構和功能都發生了一定改變，包括中樞神經系統。本實驗的研究目標探討依達拉奉的對糖尿病大鼠腦缺血損傷保護作用。方法 ①應用高劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）制作實驗型 2 型糖尿病大鼠模型。②非糖尿病大鼠（n=20）和糖尿病大鼠（n=60）均制作大腦中動脈腦缺血模型。制模后局部大腦中動脈缺血 30min 再給給予依達拉奉及 24h 再灌注。三十只糖尿病大鼠 MCAO 30min 后，立即依達拉奉（100mg/kg，腹腔）。PCR 檢測凋亡誘導因子 (AIF)被用來評估細胞凋亡。免疫組化檢測細胞色素 C。結果 依達拉奉治療后糖尿病大鼠的凋亡相關蛋白和細胞色素 C 較無藥物治療的明顯減低（P＜0.05）。免疫組化檢測細胞色素 C。結論 依達拉奉治療后糖尿病大鼠上減少改善糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷可能通過減低凋亡誘導因子，細胞色素 C。

依達拉奉；糖尿病大鼠腦缺血再灌注；細胞色素C；凋亡相關蛋白

眾所周知，糖尿病患者有中風風險高，表現在發病率以及其相關的病死率和再發率。在人類和大鼠的糖尿病，氧化應激是糖尿病主要的致病原因。依達拉奉被認為是很好的抗自由基藥物。但依達拉奉對糖尿病大鼠腦缺血再灌注的影響未見報道。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康雄性清潔級SD大鼠80只，體質量250～300g，由河南省實驗動物中心提供。大鼠被分配到三組：①M組，缺血30min，隨后再灌注24h（n=20）血糖正常大鼠；②D-M組，糖尿病大鼠30min腦缺血，再灌注24h組（n=30）；③D-A組，與糖尿病大鼠缺血30min立即腹腔注射AGM（60mg/kg溶于生理鹽水中）（n=30）。

1.2 主要試劑與儀器

依達拉奉昆明積大有限公司，國藥準字（H20080466)；細胞色素C兔抗鼠多克隆抗體( 北京博奧森bs-0013R)；PCR試劑盒、逆轉錄(RT)試劑盒(北京全式金生物技術有限公司AE301-02)。圖像采集系統(德國Leica顯微照相系統)；分析系統(上海山富科學儀器有限公司，Biosens Digital Imaging System v1．6)；RT-PCR 圖像記錄分析系統(大連Jim-X Scientific D140)；PCR GeneAmp System(美國AppliedBiosystems2700)；電泳儀(北京市六一儀器廠，DYY-6C)。

1.3 糖尿病建模

8周齡大鼠禁食10h，用STZ(Sigma 公司)溶于0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)，配成1%的溶液，按60mg/kg單次腹腔注射，5d后取尾靜脈血，用血糖儀測定血糖，血糖≥16.7mmol/L為DM大鼠(成模率100%)。將造模大鼠禁食10h后，以STZ 60mg/kg一次性腹腔內注射。24h后測血。24h后測血糖濃度＞13.8mmol/L時，成為DM模型鼠。動物用4d后無胰島素補充。

1.4 MCAO模型和分組

大鼠仰臥位被放置在一個加熱墊，使用直腸體溫保持在（37± 0.5）℃溫度計。在手術顯微鏡下包括常見的頸動脈及其分支揭露和剖析。左頸總動脈，頸外動脈，頸內動脈通過正中切口暴露。仔細分離并切斷頸外動脈分支，結扎并游離頸外動脈主干，分離頸內動脈，在頸外動脈殘端剪一小口，4-0單絲尼龍縫線與火焰圓頭通過頸外動脈的一個小切口插入。從常見的分叉的距離頸動脈縫合的一角約為18.5mm所有大鼠，這是與已公布的一致MCAO模型的描述。大鼠24h再灌注后殺害。MCAO模型成功標準選擇拔除尼龍縫線成活后，行走時向左側打彎或左側肢體癱瘓的大鼠。

表1 各組大鼠腦組織細胞色素C、AIF 表達的比較(χ—±s，n = 6)

1.5 免疫組織化學檢測細胞色素C

灌注，固定，包埋，切片。每只大鼠選取皮質區5個不同高倍視野光鏡下計數。

1.5.1 RT-PCR檢測AIF mRNA的表達

①組織總RNA提取采用Trizol一步法提取組織總RNA。②RT反應：按試劑盒說明配制反應體系，進行逆轉錄反應cDNA 20μL。③將大鼠腦組織常規研磨提取總RNA。AIF為108 bp，上游引物為：5'-TAT GAC TGGAGC TGC TAA G-3'，下游引物為：5'-GTG GGC AAA CTA CTA TCC-3'；內參照β-actin產物大小為568 bp，上游引物為：5'-CCC ATC TAT GAG GGT TAC-3'，下游引物為：5'-GGA AGG TGG ACA GTG AG-3'。擴增條件:94℃預變性2 min； 94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共30個循環；72℃總延伸6min。④瓊脂糖凝膠電泳:取5μL擴增產物與緩沖液混合后加入瓊脂糖凝膠的加樣孔中，進行電泳，后在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用圖像記錄分析系統進行分析。

1.5.2 結果判斷

目的基因AIFmRNA的表達量和β-actin的DNA條帶灰度值比值計算得到其相對含量。

1.6 統計學處理

計量資料以均數±標準差表示，組間差異采用秩和檢驗，采用SPSS 17.0軟件包進行數據處理。P＜0.05有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦組織細胞色素C表達的比較見表1。對照組和治療組大鼠腦組織皮質區細胞色素C 的表達明顯高于假手術組（均P＜0.05），但治療組大鼠腦組織皮質區細胞色素C的表達明顯低于對照組（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織AIF表達的比較見表1。對照組和治療組大鼠腦組織皮質區AIF的表達明顯高于假手術組(均P＜0.05)，但治療組大鼠腦組織皮質區AIF 的表達明顯低于對照組(P＜0.05)。

3 討 論

依達拉奉做為一種新的自由基清除劑，最早在日本上市，化學名為3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。依達拉奉有直接清除NO、羥自由基及抗氧化活性作用。能減少腦缺血動物梗死體積、提高神經功能評分及減輕腦水腫。依達拉奉作用后的主要代謝產物阻止半暗帶區細胞死亡而發揮腦保護作用，進一步明確其保護作用發生的分子機制有著重要意義，可為臨床使用自由基清除劑、改善預后，提供明確的理論基礎。

糖尿病中風的風險較非糖尿病患者增加1.5～3倍，復發中風的風險也是加倍的[1,2]。在神經元的葡萄糖毒性增加導致細胞內的葡萄糖氧化，產生活性氧[3]，氧自由基可能會導致直接損害腦線粒體損傷的神經細胞。神經元凋亡是腦缺血-再灌注后遲發性神經元死亡的基本形式[4]。線粒體代謝障礙是細胞凋亡上游的重要始動因素，細胞色素C和AIF分別代表了caspase依賴性和非caspase 依賴性細胞凋亡調節因子。細胞色素C是一種水溶性蛋白，由核基因編碼，其相對分子質量為12～13kDa，位于線粒體內膜的外側，呼吸鏈復合體Ⅲ～Ⅳ之間，對線粒體能量代謝起到了重要的調節作用。線粒體細胞色素C可以通過對凋亡信號的傳導和放大作用調控細胞凋亡。腦缺血-再灌注后，線粒體膜損傷，引起線粒體細胞色素C 釋放至胞漿，細胞色素C和凋亡蛋白酶激活因子-1，與caspase-9結合形成凋亡復合體，再活化caspase-3、7并促進凋亡復合體的形成[5,6]。本研究結果表明，缺血-再灌注可以刺激線粒體釋放促凋亡蛋白和細胞色素C，而糖尿病大鼠缺血-再灌注可增加腦缺血-再灌注后線粒體細胞色素C的釋放，依達拉奉治療后的糖尿病大鼠缺血-再灌注可減低腦缺血-再灌注后線粒體細胞色素C。AIF有線粒體定位信號，具有誘導細胞凋亡和氧化還原酶的作用。在凋亡信號刺激下，AIF轉入細胞核，與線粒體蛋白endonuclease G一起作用于核DNA導致DNA片斷化(平均50kb)[7]。AIF是一重要的非caspase依賴性凋亡調節因子。本研究結果亦發現，缺血-再灌注可刺激線粒體釋放促凋亡蛋白AIF，尤其在糖尿病大鼠的缺血再灌注中，而依達拉奉可以減少糖尿病大鼠腦缺血-再灌注后線粒體促凋亡蛋白AIF的釋放，提示依達拉奉可以通過非caspase依賴性途徑抑制細胞凋亡。綜上所述，依達拉奉可下調腦缺血-再灌注大鼠腦組織細胞色素C、AIF的表達并減少其細胞凋亡[8]。

依達拉奉抑制細胞凋亡可能與減輕線粒體損傷，抑制線粒體通路的凋亡途徑有關。

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：1671-8194（2013）03-0056-03