沙棘油抑制小鼠胸腺細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步探討

朱 煜

（山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)，山西 太原 030001）

沙棘油抑制小鼠胸腺細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步探討

朱 煜

（山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)，山西 太原 030001）

目的 初步探討沙棘油對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制。方法 取小鼠胸腺細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，分為空白對照組；LPS 組；沙棘油與 LPS 合用組。然后進(jìn)行相關(guān)基因、蛋白的檢測。結(jié)果 基因表達(dá)結(jié)果，與對照組相比：LPS 組 caspase-3 NF-κB LC3- Ⅱ表達(dá)量均增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；LPS+ 沙棘油組 caspase-3 NF-κB 表達(dá)量均增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與 LPS 組相比 LPS+ 沙棘油組 caspase-3 表達(dá)量下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）與對照組相比：LPS 刺激組 Caspase3、8、9 蛋白表達(dá)量均增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；LPS+ 沙棘油組 Caspase3、8、9 蛋白表達(dá)量均增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；與 LPS 刺激組相比 LPS+ 沙棘油組 Caspase3、9 表達(dá)量下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。結(jié)論 沙棘油對 LPS 誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞的凋亡有一定抑制作用且其抑制 casepase 通路中的線粒體途徑是其可能的機(jī)制。

沙棘油；細(xì)胞凋亡

沙棘油是從沙棘果實(shí)中提取的植物油，含有黃酮類化合物、白花青素、苦木素、香豆素、5-羥色胺等，具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤等作用[1,2]。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的特有結(jié)構(gòu)，其化學(xué)成分為脂多糖，它是導(dǎo)致膿毒癥的主要致病因子，可引起胸腺萎縮和胸腺淋巴細(xì)胞凋亡[3]。本實(shí)驗(yàn)通過LPS誘導(dǎo)胸腺淋巴細(xì)胞凋亡模型來初步探討沙棘油的抗凋亡作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CO2恒溫培養(yǎng)箱：Heraeus，德國；超凈工作臺：蘇州安泰；熒光定量PCR儀：美國STRATAGENE公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀：BIO-RAD生產(chǎn)；酶標(biāo)儀：Becton-Dickin-son美國；捷達(dá)凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)：江蘇省捷達(dá)。

脂多糖Sigma美國；Caspase-3、8、9 GAPDH、引物：寶生物工程有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒、RealMasterMix熒光染料：天根生化科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Caspase-3 goat monoclonal lgG、Caspase-8、Caspase-9rabbit monoclonal lgG：美國santa cruz公司；兔抗山羊IgG/生物素標(biāo)記、鼠抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素：北京中杉金橋。

1.2 胸腺細(xì)胞分離及細(xì)胞分組

脫臼處死小鼠，無菌取出胸腺，研磨過濾制成細(xì)胞懸液用PBS清洗后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。將接種過夜的細(xì)胞進(jìn)行分組處理，分為空白對照組；LPS組（50μg/mL）；沙棘油（50μg/mL）與LPS（50μg/mL）合用組。

1.3 基因表達(dá)情況測定

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄后，Caspase-3、GAPDH、LC3-Ⅱ、NF-κB檢測條件：94℃ 5min，94℃ 50s，53℃ 50s，72℃1min，第二步到第四步35個(gè)循環(huán)，然后94℃ 1min，55℃ 30s，95℃30s 收集熒光信號測定。

1.4 Western-blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)情況

跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、加抗體顯影后采用捷達(dá)凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用（χ—±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行兩兩比較，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 基因表達(dá)結(jié)果

與對照組相比：LPS組caspase-3 NF-κB LC3-Ⅱ表達(dá)增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LPS+沙棘油組caspase-3 NF-κB表達(dá)增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與LPS組相比LPS+沙棘油組caspase-3 表達(dá)下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 基因表達(dá)結(jié)果（χ—±s）

2.2 相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果

與對照組相比：LPS組Caspase3、8、9蛋白表達(dá)量均增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LPS+沙棘油組Caspase3、8、9蛋白表達(dá)量均增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與LPS刺激組相比LPS+沙棘油組Caspase3、9表達(dá)量下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。相關(guān)蛋白表達(dá)圖見圖1。

表2 相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果（χ—±s）

圖1 相關(guān)蛋白表達(dá)圖

3 討 論

胸腺是T淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的場所。胸腺細(xì)胞過度凋亡將影響外周T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能，影響機(jī)體免疫狀態(tài)。業(yè)已證明將內(nèi)毒素注射到小鼠體內(nèi)或?qū)⑿叵偌?xì)胞分離后體外培養(yǎng)，均可觀察到胸腺細(xì)胞明顯凋亡。

Caspase家族被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者。未活化的procaspases可分為啟動因子（如caspase-8和caspase-9）和效應(yīng)分子（如caspase-3和caspase-7），啟動caspase的激活能導(dǎo)致效應(yīng)caspase的激活[4]。Caspase-3是最主要的效應(yīng)caspase，通過兩種機(jī)制激活：死亡受體通路或線粒體通路[5]。分為caspase-8介導(dǎo)的死亡受體通路和caspase-9介導(dǎo)的線粒體通路二者均可使caspase-3激活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6,7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LPS組Casepase-3，8，9表達(dá)量均增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與LPS組相比LPS+沙棘油組Casepase-3，9表達(dá)量均有降低，提示沙棘油對LPS誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的凋亡有一定抑制作用，線粒體途徑可能是其作用機(jī)制途徑之一。

[1] 李垚,張慧穎,王鵬祖.沙棘營養(yǎng)成分及作用的研究進(jìn)展[J].中國初級衛(wèi)生保健,2007,3(21): 73-75.

[2] 賈玉,劉偉,王海平.國內(nèi)外沙棘開發(fā)研究進(jìn)展[J].科技情報(bào)開發(fā)與經(jīng)濟(jì),2005,15(14):127-128.

[3]Norimatsu M,Ono T,Aoki K,et al.In-vivo induction of apoptosis in murine lymphocytes by bacterial lipopolysaccharides[J].Med Microbial,1995,43(4):251-257.

[4]Suarez-Femandez MB,Soldado AB,Sanz-Medel A,et al.Aluminum induced degeneration of astrocytes occurs via apoptosis and results in neuronal death[J].Brain Res,1999,835(2):125-136.

[5]Van de craen M,Declercq W,Van den brande I,et al.The proteolytic procaspase activation network:an in vitro analysis[J].Cell Death Differ,1999,6(11):1117-1124.

[6]Kamenetz F,Tomita T,Hsieh H,et al.APP processing and synaptic function[J].Neuron,2003,37(6):925-937.

[7] 陳立杰,梁松嵐,梁慶成.神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷與核轉(zhuǎn)錄因子κB的激活[J].中國臨床康復(fù),2005,9(25):188-190.

R965

：B

：1671-8194（2013）06-0068-02