通過奧沙利鉑抑制PI3K/Akt通路以增強TRAIL誘導結腸癌RKO細胞凋亡敏感性的實驗研究

徐明昊，張 悅，孫明華，李恩澤，朱志圖

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體 (TRAIL)能特異地誘導腫瘤細胞凋亡，既往研究認為腸癌細胞對TRAIL不敏感［1］;近年研究發現，PI3K/Akt通路的活化可能與腸癌細胞的敏感性有關［2-3］。奧沙利鉑 (L-OHP)是第三代鉑類化療藥物，目前已廣泛應用于消化道腫瘤的治療，尤其是結腸癌的一線治療。本研究通過亞毒性劑量奧沙利鉑抑制PI3K/Akt通路以增強TRAIL誘導結腸癌RKO細胞凋亡的敏感性，探討其作用機制，為結腸癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌RKO細胞株由中國醫科大學惠贈;重組人TRAIL購于美國Cytolab/Peprotech Asia公司;奧沙利鉑購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。碘化丙啶 (PI)、甲基偶氮唑藍(MTT)、RPMI 1640培養基、RNAse購于Sigma公司;胎牛血清購于中國醫學科學院血液學研究所;兔抗人p-Akt、兔抗人Akt、兔抗人Caspase-3及鼠抗人actin抗體購自Santa Cruz公司;羊抗兔和羊抗鼠辣根過氧化物酶標記的二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞培養 人結腸癌RKO細胞株常規傳代培養，生長于含10%滅活胎牛血清、青霉素 (100 U/ml)及鏈霉素 (100 mg/ml)的RPMI 1640培養基，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內培養。

1.3 細胞增殖率 采用MTT法進行檢測，取對數生長期的細胞，0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液，調整密度為3×104/ml，接種于96孔培養板中。空白對照組加入RPMI 1640培養基，每孔終體積為200 μl。對照組加入RPMI 1640培養基繼續培養24、48、72 h，終止培養前4 h每孔加入 MTT液20 μl，到預定時間后加入二甲基亞砜 (DMSO)液200 μl;TRAIL單藥組加入25、50、100、200、400 ng/ml的TRAIL繼續培養24 h;奧沙利鉑單藥組加入10、20、40、80 μg/ml奧沙利鉑繼續培養24、48、72 h;聯合用藥組加入100 ng/ml TRAIL和40 μg/ml奧沙利鉑繼續培養24 h;各組培養完成后振蕩，采用酶聯免疫檢測儀測定570 nm處各孔吸光度值，各組實驗重復3次取平均值。計算細胞增殖率和藥物抑制細胞增殖50%的濃度 (IC50)。細胞增殖率 (%)=(處理組平均吸光度值-空白對照組平均吸光度值)/(對照組平均吸光度值-空白對照組平均吸光度值)×100%。

1.4 細胞凋亡率 采用流式細胞術進行檢測，分別收集各組細胞，1 000 r/min離心5 min，冷磷酸鹽緩沖液 (PBS緩沖液)洗滌，加入70%冷乙醇4℃固定24 h，1 000 r/min離心5 min，加入終濃度為10 mg/ml的PI，避光反應30 min后進行檢測。采用Cell Quest法計算各期細胞凋亡率。

1.5 蛋白定量 采用蛋白印跡法 (Western blot)檢測各組細胞蛋白變化，分別收集各組細胞，冷PBS緩沖液洗滌2次后加入1%Triton裂解液〔1%Triton X-100，50 mmol/L Tris-Cl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，100 mmol/L氟化鈉 (NaF)，1 mmol/L釩酸鈉(Na3VO4)，1 mmol/L苯甲基磷酰氟 (PMSF)，2 μg/ml aprotinin〕，冰上裂解30 min，之后高速離心 (15 000 r/min)30 min，取上清液，Lowry法進行蛋白定量。將樣品與3×樣品緩沖液混合后煮沸5 min，于10%SDS-聚丙烯凝膠中電泳，之后電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗p-Akt、Akt、Caspase-3及actin，4℃孵育過夜。TBST〔10 mmol/L Tris(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，0.1%Tween20〕洗滌4次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育30 min，TBST沖洗，采用ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統成像并分析處理。

1.6 細胞形態 采用瑞氏-吉姆薩染色法，將細胞種于6孔板中，調整濃度為2.5×104/孔，培養箱內過夜后收集各組細胞，2 000 r/min離心機甩片3 min制成細胞涂片，瑞氏-吉姆薩染液 (Sigma)染色，15 min后流水沖洗，干燥后光學顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.7 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以 (x±s)表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖率 TRAIL單藥組24 h時細胞增殖率分別為(108.8±6.4)%、 (113.2±12.1)%、 (101.5±5.8)%、(96.8±5.0)%、(90.2±7.2)%，與對照組比較，差異均無統計學意義 (對照組細胞增殖率均為100%，t值分別為1.231、1.385、0.074、0.998、1.976，P ＞0.05，見圖 1A)。奧沙利鉑單藥組24、48、72 h時 IC50分別為 (44.3±7.6)ng/ml、(22.3 ±6.1)ng/ml、 (9.8 ±4.5)ng/ml，與對照組比較，差異均有統計學意義 (對照組IC50均為0，t值分別為10.096、6.332、3.772，P＜0.05，見圖1B)。聯合用藥組24 h時細胞增殖率為 (30.6±2.7)%，40 μg/ml奧沙利鉑單藥組為 (48.4±5.2)%，差異有統計學意義 (t=9.607，P＜0.05，見圖1C)。

2.2 細胞凋亡率及蛋白定量 對照組細胞凋亡率為 (0.9±2.7)%，100 ng/ml TRAIL組為 (2.5±2.1)%，40 μg/ml奧沙利鉑組為 (9.6±1.9)%，聯合用藥組為 (23.5±3.5)%(見圖2A)。100 ng/ml TRAIL組細胞凋亡率與對照組比較，差異無統計學意義 (t=0.956，P＞0.05);40 μg/ml奧沙利鉑組、聯合用藥組細胞凋亡率與對照組比較，差異均有統計學意義 (t值分別為4.971和8.856，P＜0.05)。

100 ng/ml TRAIL組1、3、6、12、24 h時 p-Akt活化性逐漸增強，于6 h和12 h時達到高峰，24 h時開始減弱 (見圖2B)，沒有觀察到活化的Caspase-3(見圖2C);40 μg/ml奧沙利鉑組和聯合用藥組p-Akt活化性被明顯抑制，可以觀察到活化的Caspase-3(見圖2C)。

圖1 TRAIL和奧沙利鉑對結腸癌RKO細胞增殖率的影響Figure 1 Effects on cell proliferation rate of colon cancer RKO treated by TRAIL and oxaliplatin

圖2 TRAIL和奧沙利鉑對結腸癌RKO細胞PI3K/Akt通路的影響Figure 2 Effects on PI3K/Akt pathway of colon cancer RKO treated by TRAIL and oxaliplatin

圖3 奧沙利鉑作用結腸癌RKO細胞形態學的影響 (瑞氏-吉姆薩染色，×200)Figure 3 Effects on cell morphology of colon cancer RKO treated by oxaliplatin

2.3 細胞形態 對照組細胞形態正常 (見圖3A)，40 μg/ml奧沙利鉑組可見典型的凋亡小體 (見圖3B)。

3 討論

結腸癌是世界第3常見惡性腫瘤［4-5］，近年來其發病率呈上升趨勢，雖然結腸癌的外科治療已取得巨大進步，但因早期診斷率不高，多數患者就診時已屬晚期。第三代化療新藥和分子靶向藥物的應用可顯著提高結腸癌患者的生存期，但其5年生存率仍不能令人滿意，究其原因，可能是腫瘤患者異質性及化療藥物耐藥而導致化療失敗。因此，尋找新型抗腫瘤藥物已成為國內外研究熱點。

目前，誘導腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的研究熱點之一，而新近發現的TRAIL可不影響正常細胞的生長與分化，選擇性地誘導多種腫瘤細胞凋亡［6-7］，在腫瘤的靶向治療中具有良好的應用前景［8］。但部分體外實驗研究顯示，腫瘤細胞對TRAIL誘導的凋亡作用不敏感甚至完全耐受［9-10］，而獲得性耐藥嚴重妨礙著其臨床應用［11］。本實驗研究結果顯示，采用MTT法檢測的不同濃度TRAIL作用于結腸癌RKO細胞的細胞抑制率與對照組比較，均無明顯差異，表明TRAIL對結腸癌RKO細胞不敏感。如何有效地增強腫瘤細胞對TRAIL的敏感性就成為首要解決的問題。

有研究發現PI3K/Akt信號通路高度活化是結腸癌細胞對TRAIL不敏感的重要原因［12］。PI3K/Akt信號通路廣泛存在于細胞中，通路活化可以抑制癌細胞凋亡、促進癌細胞增殖，與結直腸癌的發生發展密切相關。本實驗研究蛋白定量結果提示，TRAIL參與結腸癌RKO細胞PI3K/Akt的通路活化，可導致結腸癌RKO細胞對TRAIL不敏感。研究表明，紫杉醇、順鉑等化療藥物可增強TRAIL的敏感性［13-15］。奧沙利鉑作為繼順鉑和卡鉑之后的第三代鉑族金屬抗腫瘤藥物，能夠抑制結腸癌細胞PI3K/Akt通路活化［16-17］，PI3K/Akt通路可能是奧沙利鉑的作用靶點。本研究結果顯示，40 μg/ml奧沙利鉑作用結腸癌RKO細胞24 h，細胞凋亡率為 (9.6±1.9)%，明顯高于對照組，且抑制了p-Akt活化性，可以觀察到活化的Caspase-3。聯合用藥組細胞凋亡率提到 (23.5±3.5)%，且同樣抑制了p-Akt活化性，可以觀察到活化的Caspase-3，且其作用較40 μg/ml奧沙利鉑單藥組略有增強，提示奧沙利鉑可引起結腸癌RKO細胞凋亡，并通過抑制Akt的活化而提高結腸癌RKO細胞對TRAIL的敏感性。

綜上所述，奧沙利鉑可通過抑制PI3K/Akt通路活化而增強TRAIL誘導結腸癌RKO細胞凋亡的敏感性，提高結腸癌細胞對TRAIL的敏感性，為結腸癌的靶向治療提供了新的思路。

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