重組人生長激素對人乳腺癌細胞生長的影響及機制的研究

張曉娟，栗紅蕊，崔 巖，王守俊

重組人生長激素 (r-hGH)作為外源性生長激素已廣泛應用于臨床，大量研究表明r-hGH在增強蛋白質合成代謝、克服手術和化療引起的免疫功能下降、加速創口愈合及減少并發癥等方面有重要臨床意義。r-hGH是否會促進惡性腫瘤細胞生長已引起臨床注意。本研究選用雌激素受體陽性 (ER+)的MCF-7人乳腺癌細胞株和雌激素受體陰性 (ER-)的MDA-MB-231人乳腺癌細胞株進行體外培養，以探討r-hGH對不同類型人乳腺癌細胞生長的影響及可能涉及的信號通路，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗用品及化學試劑 人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。r-hGH(SAIZEN)購自瑞士Serono公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(ser473)、細胞外信號調節蛋白激酶1/2(Erk1/2)、磷酸化Erk1/2抗體，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG均購自上海碧云天生物技術公司。

1.2 細胞培養 人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞培養于含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基中，在37℃、5%CO2濕潤的環境中培養。

1.3 MTT法測細胞增殖 取對數生長期的MCF-7和MDAMB-231細胞調整細胞濃度為4×104/ml，接種于96孔板中，待細胞貼壁后，行以下處理: (1)以500、1 000、2 000、4 000 μg/L r-hGH作用 48 h;(2)以 4 000 μg/L r-hGH 作用24、48、72、96 h，每組設6個復孔，以上均設未處理對照組。每孔加入 MTT液 (5 mg/ml)20 μl，振蕩后繼續于37℃、5%CO2環境中孵育4 h，吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜 (DMSO)200 μl，振蕩5 min，用酶標儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度 (A值)。實驗重復3次。

1.4 流式細胞儀測細胞周期 細胞以1×105個/孔接種于6孔板，貼壁48 h，用4 000 μg/L r-hGH作用于細胞，設立陰性對照組。培養48 h，收集細胞，磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌2次，離心后的細胞沉淀用70%乙醇2 ml重懸，4℃過夜，50 g/L碘化并啶 (PI)染液染色，4℃避光30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.5 Western blot檢測Erk1/2、Akt的表達 細胞以8×104個/孔接種于6孔板，貼壁48 h，4 000 μg/L r-hGH作用48 h，設立對照組，提取細胞總蛋白;BCA法測定蛋白濃度;SDSPAGE膠上每泳道上樣100 μg蛋白，進行電泳，轉膜，封閉，一抗 (1∶600)搖床4℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3，加HRP標記的二抗 (1∶1 000)孵育1 h，洗滌后DAB顯色。

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以 (x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度r-hGH對MCF-7和MDA-MB-231細胞生長的影響 與對照組相比，以500、1 000、2 000、4 000 μg/L的r-hGH作用48 h后MCF-7細胞和MDA-MB-231增殖不明顯，差異無統計學意義 (F值分別為3.156和2.321，P值分別為0.968和0.823，見圖1、2)。

2.2 不同作用時間r-hGH對MCF-7和MDA-MB-231細胞生長影響 與對照組相比，以4 000 μg/L r-hGH作用24、48、72、96 h后MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞增殖不明顯，差異無統計學意義 (F值分別為19.032和1.982，P值分別為0.321和0.076，見圖3、4)。

圖1 不同濃度r-hGH對MCF-7細胞增殖的影響 (n=12)Figure 1 Comparison of absorbance in MCF-7 cells with different concentration of r-hGH

圖2 不同濃度r-hGH對MDA-MB-231細胞增殖的影響(n=12)Figure 2 Comparison of absorbance in MDA-MB-231 cells with different concentration of r-hGH

圖3 4 000 μg/L r-hGH作用不同時間時MCF-7細胞A值的比較(n=12)Figure 3 Comparison of absorbance in MCF-7 cells with different time of r-hGH

圖4 4 000 μg/L r-hGH作用不同時間時MDA-MB-231細胞A值的比較 (n=12)Figure 4 Comparison of absorbance in MDA-MB-231 cells with different time of r-hGH

2.3 流式細胞術測定r-hGH對MCF-7和MDA-MB-231細胞周期的影響 以4 000 μg/L r-hGH作用MCF-7和MDA-MB-231細胞48 h后，兩組各期細胞間差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表1、2)。

2.4 Western blot法測定胰島素作用MCF-7細胞48 h Erk1/2和Akt表達情況 以4 000 μg/L r-hGH作用MCF-7和MDA-MB-231細胞48 h后，Erk1/2和Akt磷酸化程度與對照組比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表3、4，圖5、6)。

表1 以4 000 μg/L r-hGH作用MCF-7細胞48 h后兩組細胞周期結果(x ±s，%)Table 1 Effect of r-hGH on cell cycle of MCF-7 cells between two groups

表2 以4 000 μg/L r-hGH作用MDA-MB-231細胞48 h后兩組細胞周期結果 (x ±s，%)Table 2 Effect of r-hGH on cell cycle of MDA-MB-231 cells between two groups

表3 r-hGH作用MCF-7細胞后兩組Erk1/2和Akt磷酸化程度比較(x ±s，%)Table 3 Phosphorylation of Erk1/2 and Akt of MCF-7 cells after treated with r-hGH

表4 r-hGH作用MDA-MB-231細胞后Erk1/2和Akt磷酸化程度比較(x ±s，%)Table 4 Phosphorylation of Erk1/2 and Akt of MDA-MB-231 cells after treated with r-hGH

圖5 r-hGH作用MCF-7細胞后Erk1/2和Akt及其磷酸化蛋白的表達Figure 5 Expression of Akt，P-Akt，Erk1/2 and P-Erk1/2 in MCF-7 cells after treated with r-hGH

圖6 r-hGH作用MDA-MB-231細胞后Erk1/2和Akt及其磷酸化蛋白的表達Figure 6 Expression of Akt，P-Akt，Erk1/2 and P-Erk1/2 in MDAMB-231 cells after treated with r-hGH

3 討論

有研究表明，r-hGH可以通過作用于肝臟細胞膜上生長激素受體 (GHR)產生生長介素如胰島素樣生長因子-1(IGF-1)而促進全身組織細胞的生長和增殖［1-2］，而生長激素的生物效應絕大部分是通過IGF1介導發揮的，Mathews等［3］發現許多組織細胞內 (如骨骼系統、中樞神經系統、胃腸道、肝臟、腎臟等)有GHR的存在或GHR mRNA的表達。r-hGH是否會促進腫瘤生長、復發和轉移，一直是國內外學者關注的問題。大量研究證實，IGF-1與受體結合后通過絲裂原激活蛋白激酶 (MAPK)途徑和磷脂酰肌醇3激酶(P13K)途徑促進細胞的增殖、存活及遷移，并抑制細胞凋亡［4］。對腫瘤細胞而言，IGF-1是很強的絲裂原，介導GH的促生長作用，與人體多種腫瘤的發生有一定關系［5-6］。

由于乳腺癌死亡者占女性腫瘤死亡的14%［7］，嚴重威脅女性的健康和生命。乳腺癌患者能否應用外源性GH，延緩機體總蛋白的丟失，改善營養，增進免疫功能，減少病死率?為了觀察r-hGH對乳腺癌細胞增殖的影響，考慮不同類型的乳腺癌細胞中GHR或IGF-1R表達不同［8］，可能會使r-hGH對其生長的影響也不同，本實驗選用ER+的MCF-7人乳腺癌細胞株和ER-的MDA-MB-231人乳腺癌細胞株，采用r-hGH以不同濃度和時間作用于兩種細胞，以500、1 000、2 000、4 000 μg/L r-hGH 作用 48 h 或 4 000 μg/L r-hGH 作用24、48、72、96 h后，兩種細胞的增殖程度間無明顯差異;為了進一步提高結果的可靠性，以4 000 μg/L r-hGH作用48 h，用流式細胞儀檢測發現細胞周期變化較對照組無明顯差異;接著對Erk1/2和Akt磷酸化程度檢測，發現兩種細胞中r-hGH組Erk1/2和Akt磷酸化程度較對照組無明顯差異，提示IGF-1R和GHR下游的MAPK/ERK、PI3K/Akt信號通路未被激活。

本研究證實r-hGH在體外無促進乳腺癌細胞生長的作用，Erk1/2和Akt的磷酸化程度無明顯升高;同時廖清華等［9］報道r-hGH能增強5-氟脲嘧啶對人乳腺癌細胞的化療效果。這些均為腫瘤患者術后應用r-hGH進行代謝調理和改善不能手術的中晚期腫瘤患者的惡病質及降低化療毒副作用提供了一定的實驗依據。但由于本實驗為體外細胞實驗，可能在GHR的分布、IGF-1的多因素調節、癌細胞生長環境等方面與體內存在差別。因此，需要體內實驗即動物模型進行進一步驗證。

1 蘇成安.重組人生長激素治療青春期前特發性矮小癥50例療效分析［J］.海南醫學院學報，2010，16(8):1051-1053.

2 段艷峰.河南安陽地區重組人生長激素治療少年兒童特發性矮小癥療效分析［J］.中國全科醫學，2011，14(11):3857.

3 Mathews LS，Enbery B，Norstedt G.Regulation of rat growth hormone gene expression［J］ .J Biol Chem，1989，264(17):9905-9910.

4 彭珊璐，馮國祝，王國香，等.新生兒缺氧缺血性腦病血清胰島素樣生長因子-1測定的意義［J］.實用心腦肺血管病雜志，2012，20(4):601.

5 Favoni RE，De-Cupis A，Ravera F，et al.Expression and function of the insulin-like growth factor-1 system in human non-small cell lung cancer and normal lung cell lines ［J］ .Int J Cancer，1994，56(6):858-866.

6 李旭，姚智.不同類型腦腫瘤患者血清胰島素樣生長因子-Ⅰ檢測的臨床意義 ［J］.中國全科醫學，2011，14(8):2687.

7 Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):3322.

8 Bartucci M，Morelli C，Mauro L，et al.Differential insulin-like growth factor 1 receptor signaling and function in estrogen receptor-positive MCF-7 and ER-negative MDA-MB-231 breast cancer cells［J］ .Cancer Res，2001，61(18):6747-6754.

9 廖清華，吳向華，陸云飛，等.重組人生長激素與5-FU聯合應用對人乳腺癌細胞株MCF-7細胞周期作用的實驗研究［J］.廣西醫科大學學報，2006，28(4):492-495.