肺通口服液對大鼠急性肺損傷的治療作用及其機制

張 欣，王丁丁，牟 潔

(1青島大學醫學院附屬醫院，山東青島266003;2濟南市第四人民醫院;3山東醫學高等專科學校藥學系)

急性肺損傷(ALI)以大量活化的中性粒細胞(PMN)在肺血管和間質聚集為病理特征，活化的PMN釋放中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)，損傷毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞，消化和降解細胞外基質及上皮連接結構，參與和啟動 ALI的發生［1］。本研究觀察了肺通口服液對ALI大鼠血清中NE含量的影響，旨在探討其對ALI的治療作用及機制。

1材料與方法

1．1 材料 40只雄性SD大鼠，體質量180～200 mg，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供;博來霉素(8 mg/支)購自天津太和制藥有限公司;氫化考的松(25 mg/支)購自天津生物化學制藥廠;肺通口服液(20 mL/支)購自濟南宏濟堂制藥有限公司;Anti-Elastase NE抗體IgG試劑盒96T購于德國BL公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 動物分組及處理 取40只雄性SD大鼠，隨機分為模型組、治療組、激素組、正常對照組各10只。①模型組:采用BLEMA5法制備肺間質纖維化模型。用2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，以仰臥位固定在鼠板上，固定四肢、頭部，用開鼻器撬開口腔后將舌輕輕拉出，壓迫舌腹，暴露喉頭，在額鏡注視下，在大鼠吸氣瞬間迅速將與1 mL注射器相連的鈍頭9號腰穿針插入氣管，約達氣管分叉處，緩慢注入5 mg/kg平陽霉素(用生理鹽水0．5 mL/mg溶解)和0．5 mL空氣，其后立即將動物直立旋轉，使藥物在肺內分布均勻(如發生窒息，立即進行人工心臟按摩)，動物清醒后常規飼養28 d。②治療組:按模型組方法一次性氣管內注入平陽霉素，24 h后每日予肺通口服液250 mg/kg(用生理鹽水溶解后2～4 mL/只)灌胃1次，共28 d。③激素組:按模型組方法一次性氣管內注入平陽霉素，24 h后每日肌注氫化考的松25 mg/kg，共28 d。④正常對照組:按模型組處理，僅將氣管內注入藥物改為生理鹽水2 mL/kg，常規飼養28 d。

1．2．2 標本取材 各組于實驗14、28 d分別經左側頸內靜脈抽取靜脈血2 mL，其后經腹主動脈放血處死，立即開胸取右肺中葉，置于4%多聚甲醛/0．1 PBS(pH 值7．0～7．4)中，以含 1/1 000 DEPC 的固定液固定1 h，常規脫水、浸蠟、包埋，切片厚度為6～8μm。

1．2．3 肺組織形態學觀察 ①大體所見。②HE染色:按Szapie方法確定肺泡炎和肺間質纖維化程度。肺泡炎分為四級，其中0級指無肺泡炎(－);1級指輕度肺泡炎(+)，受累面積＜全肺20%;2級指中度肺泡炎(++)，受累面積占20% ～50%;3級指中度肺泡炎(+++)，受累面積＞50%。肺間質纖維化分為四級，其中0級指無肺間質纖維化(－);1級指輕度肺間質纖維化(+)，病變范圍局限在全肺20%以下;2級指中度肺間質纖維化(++)，病變范圍占全肺20% ～50%;3級指重度肺間質纖維化(+++)，病變范圍＞50%，肺泡融和，肺實質結構紊亂。③VG染色:觀察肺泡膠原沉積和纖維化情況。

1．2．4 血清NE含量檢測 取實驗14、28 d抽取的靜脈血，靜置15 min，4℃下3 000 r/min離心15 min，離心半徑15 cm，收集血清，40℃保存。用ELISA法測定血清NE含量。

1．3 統計學方法 采用SPSS13．0統計軟件。計量數據用±s表示，各組樣本均數的比較采用方差分析。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 各組肺組織形態學變化 ①大體所見:正常對照組雙肺外觀無異常，表面光滑、飽滿，呈粉紅色;模型組表面凹凸不平，多呈暗紅色，邊緣有點狀出血，部分肺葉體積縮小、呈灰白色、表面有白色結節;治療組與正常對照組相似，部分肺葉呈暗紅色;激素組與模型組相似，部分肺葉表面光滑。②HE染色:正常對照組肺泡及間隔結構正常;模型組可見肺泡結構破壞，灶性纖維化形成，分布不均，肺泡間隔增厚，部分肺泡腔縮小甚至消失，肺實質結構紊亂，部分局部炎細胞浸潤;治療組可見肺泡間隔增厚程度減輕，炎性細胞較少，肺泡結構基本正常;激素組肺泡炎及纖維化減輕不甚明顯。模型組肺泡炎以1、2級為主，肺間質纖維化以2、3級為主;治療組肺泡炎及肺間質纖維化均為0級或1級;激素組肺泡炎主要為1級，肺間質纖維化以1、2級為主。③VG染色:正常對照組肺泡結構正常，偶見膠原纖維;模型組肺實質結構紊亂，可見肺間質大量紅色膠原纖維沉積，肺泡腔縮小;治療組膠原纖維較少，肺實質結構基本正常;激素組可見不同程度的膠原纖維沉積。

2．2 各組血清NE含量比較 模型組和激素組第14、28天血清NE含量較正常對照組顯著增高(P均＜0．01);治療組第14、28天血清 NE含量較模型組和激素組顯著降低(P均＜0．01)，詳見表1。

表1 各組大鼠血清NE含量比較［ρ/(μg·mL)±s］

表1 各組大鼠血清NE含量比較［ρ/(μg·mL)±s］

注:與正常對照組相比，*P＜0．01;與模型組和激素組相比，△P＜0．01

組別 n NE 14 d 28 d模型組 10 12．91 ±2．78* 17．09 ±6．99*10 3．98 ±1．34 4．60 ±2．67激素組 10 12．66 ±2．95* 20．57 ±4．74*治療組 10 3．88±2．01△ 3．01±1．65△正常對照組

3 討論

ALI是全身失控性炎癥反應的肺部表現，其中激活的PMN在肺內聚集是導致肺損傷發生、發展的重要步驟［2，3］。肺間質纖維化的病理特征是大量活化的PMN在肺血管和問質聚集，活化的PMN釋放NE和氧自由基［2］，而NE可通過水解肺彈性蛋白、蛋白多糖和膠原直接損傷肺血管內皮細胞和血管基底膜，并有可能是全身炎癥反應綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)時各種原因導致肺間質纖維化的共同通路［1，4］。NE 由 PMN 合成、儲存和釋放，又可反饋性調控PMN的生成、游走和浸潤，兩者之間形成負反饋調節網絡［5］。NE是一種蛋白溶解酶，作用底物十分廣泛，包括細胞外基質成分和多種可溶性蛋白［4，6］。NE的最適底物是彈性蛋白，彈性蛋白被分解時，上皮及內皮細胞間的緊密連接被破壞，毛細血管通透性增加，大量血漿成分和活性物質滲透至肺間質，使肺水腫形成［4，6］。NE還可誘導細胞因子粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)、IL-6、IL-8等的表達，趨化并激活更多的PMN［7］，使肺部炎癥反應和肺損傷不斷放大。

目前研究認為，NE在ALI成人呼吸窘迫綜合征(ALIYARDS)發病中起著十分關鍵的作用［8］，減少NE釋放和降低NE活性是藥物治療ALI的有效途徑。有研究表明使用蛋白酶抑制劑可明顯降低NE活性，減輕缺血/再灌注后肺損傷［9］。肺通口服液是以益氣養陰、清熱化痰、止咳化痰為治則，由黃芪、黨參、麥冬、沙參、當歸等組方的中成藥物。本研究顯示，正常對照組雙肺外觀無異常，HE、VG染色所示肺組織學形態亦正常，模型組肺組織均出現出血及壞死(提示制模成功)，激素組肺泡炎和肺間質纖維化程度與模型組相似，治療組肺泡炎和肺間質纖維化程度與激素組和模型組相比顯著減輕;治療組第14、28天血清NE含量較模型組和激素組顯著降低。提示肺通口服液能減輕內毒素所致肺間質纖維化大鼠的肺組織損傷，機制可能與其降低血清中NE表達、降低肺泡毛細血管通透性、減輕肺水腫有關。

綜上所述，肺通口服液能減輕ALI大鼠的肺泡炎和肺間質纖維化程度，可能機制是通過減少血清NE釋放降低肺泡毛細血管通透性、減輕肺水腫。

［1］高冬娜，張彧．中性粒細胞彈性蛋白酶致急性肺損傷機制的研究進展［J］．中國危重病急救醫學，2006，18(8):510-512．

［2］曹慧玲，呂世杰，姜艷霞，等．急性肺損傷大鼠氧自由基變化及不用中藥治療作用的對比［J］．中國中西醫結合急救雜志，2006，13(3):146-149．

［3］李瑜，張林，褚海辰，等．大黃對家兔內毒素性急性肺損傷的保護作用研究［J］．中國中西醫結合急救雜志，2005，12(3):173-176．

［4］Moraes TJ，Chow CW，Downey GP．Proteases and lung injury［J］．Crit Care Med，2003，31(4 Suppl):S189-194．

［5］El-Ouriaghli F，Sloand E，Mainwaring L，et al．Clonal dominance of chronic myologenous leukemia is associated with diminished sensitivity to the antiprolifer ative effects of neutrophil elastase［J］．Blood，2003，102(10):3786-3792．

［6］ Carden D，Xiao F，Moak C，et al．Neutrophil elastase promotes lung microvascular injury and proteolysis of endothelial cadherins［J］．Am J Physiol，1998，275(2):385-392．

［7］Lee WL，Downey GP．Leukocyte elastase:physiological functions and role in acute lung injury［J］．Am J Respir Crit Care Med，2001，164(5):896-904．

［8］揭志軍，楊文蘭．中性粒細胞彈性蛋白酶在急性肺損傷發病中的作用［J］．國外醫學:內科分學冊，1999，26(10):439-441．

［9］王剛，陳婷婷，高長青，等．烏司他丁對創傷失血性休克兔肺損傷的保護作用［J］．中國危重病急救醫學，2005，17(1):36-38．