正交設計優選痹痛貼提取揮發油的水煎液的除雜工藝

奚建，李建利

痹痛貼是由獨活、川芎、肉桂、乳香、沒藥等藥材經過提取、濃縮、成型等步驟制備的貼劑，具有活血化瘀，消腫止痛的功效，用于治療各種痹癥。方中獨活為君藥，其發揮鎮痛、鎮靜和抗炎、解痙、抗血栓作用的主要物質基礎主要為香豆素類化合物，川芎、肉桂等藥材主含揮發油；乳香、沒藥[1]中發揮鎮痛、抑制炎癥、抗血栓等作用的物質基礎主要為樹脂成分。故筆者擬定了對方中川芎、肉桂等藥材先提取揮發油，提揮發油后的藥渣再與剩余藥材乙醇回流提取的工藝。由于傳統用藥都是水煎，故提取揮發油所得水提取液也應作為處方藥效成分，但由于水煎液多含有蛋白質、多糖、淀粉、黏液質等雜質，使藥效成分含量降低，影響療效；故本文主要對按試驗優選出的最佳提取揮發油工藝后的水煎液進行除雜研究，采用乙醇沉淀法，以藥液比、含乙醇量為考察因素，以醇浸膏收率和阿魏酸的含量為評價指標，通過正交設計表來安排實驗，來優化最佳工藝。

1 儀器與試藥

川芎、肉桂等藥材購自四川科倫天然藥業有限公司，經成都中醫藥大學盧先明教授鑒定，藥材符合《中國藥典》2010年版要求[2]，阿魏酸對照品（批號110773-200611）購自中國藥品生物制品檢定所），甲醇為色譜純，純凈水(哇哈哈純凈水)，其余所用試劑均為分析純。

島津LC-20AT型高效液相色譜儀（SPD-20A 紫外檢測器）；METTLER TOLEDO電子天平(AB204-E)。

2 方法與結果

2.1 阿魏酸含量測定

2.1.1 色譜條件[2]色譜柱Kromasil C18（5μm，250×4.6mm）；流動相甲醇-0.1%醋酸水（35：65）；流速1.0 mL.min-1；柱溫30℃；檢測波長320 nm。

2.1.2 方法專屬性考察 對照品溶液的制備 精密稱取蛇床子素對照品適量，用甲醇溶解制成15μg/ml的溶液即得。

供試品溶液的制備 分別精密吸取各樣品提取溶液5ml，揮干，用甲醇溶解，并定容至25ml容量瓶，取溶液適量微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得。

方法專屬性 分別精密吸取蛇床子素對照品溶液，供試品溶液各15μL，分別注入液相色譜檢測，阿魏酸對照品，供試品在9.5min左右出現阿魏酸吸收峰。

2.1.3 線性關系考察 精密吸取對照品（15μg/ml）溶液2、4、8、10、16μl，按上述色譜條件注入液相色譜儀，測定。以進樣量為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，計算回歸方程為：Y=1E+06X-272621（r=0.9997）。結果表明阿魏酸在0.03～0.24μg之間有良好的線性關系。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取阿魏酸對照品溶液，重復進樣5次，以蛇床子素峰面積計算，RSD為0.86%。

2.1.5 穩定性考察 精密吸取同一供試品5μL，分別在0，2，4，6，8，10 h測定峰面積，RSD為1.20%(n=6)，表明供試品在10 h內穩定。

2.1.6 阿魏酸含量測定 分別取“2.2”項下得到的9組供試品溶液，0.45μm微孔濾膜過濾，各精密吸取15μl，分別進樣，測定峰面積，計算阿魏酸的含量。結果見表2。

2.2 正交試驗

影響醇沉除雜效果的因素有藥液含醇濃度，初始藥液質量濃度和靜置時間、醇沉次數等，參考相關文獻[3]并結合預試驗，并考慮到痹痛貼的提取工藝線路，選擇藥液含醇濃度和初始藥液質量濃度為考察因素，并考慮兩因素交互作用，按表2進行正交試驗，以浸膏收率和阿魏酸的含量為評價指標。按L9(34)正交表進行設計。因素水平見表1。

表1 因素水平表

將提揮發油水煎液濃縮至一定的質量濃度，加入95%乙醇使藥液中乙醇達到一定濃度值，冷藏24小時，抽濾，濾液回收乙醇后定容至100mL，即得得1～9號樣品溶液，測定含量。分別吸取定容后的樣品溶液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，取出，迅速稱量，計算浸出物得率。結果見表2。

浸出物得率=醇沉后浸膏質量/初始浸膏質量×100%

表2 正交試驗結果及計算表

表3 醇浸膏方差分析

表4 阿魏酸含量方差分析

2.3 結果分析

以浸膏得率為考察指標，各因素作用主次為B＞A，方差分析表明B因素有顯著性影響，A×B無顯著性影響，說明A與B無交互作用，醇沉后浸膏率以少為宜，故以A1B3為佳。以阿魏酸含量為考察指標，各因素作用主次為A＞B，方差分析表明均無顯著性影響，以A1B2為佳。考慮到阿魏酸含量的重要性，故最后選擇A1B2，即初始藥液質量濃度為1.0～1.10g/ml，加95%乙醇醇沉，使含醇量達70%。

2.4 驗證試驗

按確定的除雜工藝進行平行3次驗證試驗，結果3次試驗浸膏得率分別為14.08%，14.13%，14.16%，平均值為14.12%；阿魏酸含量分別為2.03，2.32，2.45mg，平均值為2.27mg。表明該提取工藝穩定、可行。

3 討論

本實驗優選的痹痛貼水提取液最佳醇沉工藝為初始藥液質量濃度為1，加95%乙醇醇沉，使含醇量達70%，在此工藝條件下, 阿魏酸的含量較高和浸出物得率適中；對于影響乙醇醇沉的因素中，初始質量濃度過高的藥液黏稠度高, 難以與乙醇充分接觸,析出的沉淀易包裹藥液而造成有效成分損失；初始質量濃度過低則藥液量大, 耗費乙醇, 延長時間。因此選擇了1.0～1.10g/ml，1.10～1.15g/ml，1.15～1.20g/ml三個范圍的初始質量濃度為考察指標；對于藥液含醇濃度，濃度太低，乙醇用量大浪費，回收不方便，且沉淀成絮狀，難以下沉，效果差；濃度太高，得到的醇提液較少，沉淀中含有大量的有效物質，且加入高濃度乙醇，易造成局部濃度過高，形成大塊沉淀，將有效成分包裹，隨沉淀除去，并參考相關文獻[3]，選擇藥液含醇量分別為50%、60%、70%三個水平考察對所測指標的影響。另外預實驗對醇沉次數的研究表明，醇沉次數并無顯著影響，且從簡化工藝、節約生產成本選擇醇沉一次。

[1] 徐艷.乳香、沒藥的炮制使用[J].安徽預防醫學雜志,2004,10(5):317.

[2] 中國藥典.一部[S].2010:38,127.

[3] 玄律,倪健.多指標優選醒目顆粒水提醇沉制備工藝[J].中成藥雜志,2010,32(7):1238.