家蠅3齡幼蟲石蠟切片的組織學(xué)研究

胡 蓉，張 姝，吳建偉，國 果，付 萍

(貴陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004)

石蠟切片技術(shù)是組織學(xué)研究最基本的實(shí)驗(yàn)方法。昆蟲消化系統(tǒng)石蠟切片的組織學(xué)研究報(bào)道較多，如韭菜遲眼蕈蚊幼蟲(Song et al.，2004)、興義維蚋成熟幼蟲(Xun et al.，2011)、黃臉油葫蘆(Lu et al.，2009)等。但昆蟲堅(jiān)硬的外殼(皮)和開放的循環(huán)系統(tǒng)等卻制約了整蟲組織的石蠟切片制作，昆蟲整蟲石蠟切片的組織學(xué)研究報(bào)道較少，具有代表性的是改良的石蠟切片法研究致倦庫蚊組織結(jié)構(gòu)(Yan et al.，2011)。家蠅Musca domestica 是分布廣泛的環(huán)境昆蟲(Su ZJ et al.，2010)，其組織器官的結(jié)構(gòu)及功能分子的定位一直備受關(guān)注，國內(nèi)的研究主要有:3齡幼蟲血細(xì)胞體外熒光染色(Liu et al.，2008)、雌家蠅產(chǎn)卵器和足上感受器的掃描電鏡觀察(Wang and Mo，2010)，利用冰凍切片定位抗菌肽基因(Yang et al.，2012)等;國外的主要研究是通過電鏡觀察蛹(Siriwattanarungsee et al.，2005)、1齡幼蟲(Szpila and Pape，2008)、馬氏管(Sohal，1974)和唾液腺(Lietze et al.，2011)的超微結(jié)構(gòu)，在定位基因表達(dá)部位時(shí)涉及到成蟲頭部石蠟切片(Codd et al.，2007)以及幼蟲和成蟲中樞神經(jīng)系的組織切片(Sha et al.，2012)。關(guān)于家蠅整蟲石蠟切片的組織學(xué)研究尚未見報(bào)道。本研究以家蠅3齡幼蟲為研究對象，探索合適的石蠟切片制作方法，并通過蘇木精－伊紅(hematoxylin－eosin，HE)染色、過碘酸－希夫氏(periodic acid－schiff，PAS)染色顯示家蠅幼蟲的組織結(jié)構(gòu)以及多糖和糖蛋白的分布，為家蠅3齡幼蟲的組織學(xué)研究提供系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)資料，并為進(jìn)一步定位家蠅的功能分子提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)昆蟲

家蠅幼蟲為貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室馴化飼養(yǎng)多代的室內(nèi)種群。

1.1.2 主要試劑及儀器

多聚甲醛(Sigma)，蘇木精(Sigma)，伊紅(Sigma)，石蠟、過碘酸、堿性品紅等為國產(chǎn)分析純，A0821S 回轉(zhuǎn)式切片機(jī)(AO)，載玻片烘干機(jī)(Leica)，DME 321058943PX 顯微鏡帶一體化攝像頭(Leica)。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片的制備

按照杜卓明主編《實(shí)用組織學(xué)技術(shù)》配制相關(guān)試劑并制作家蠅3齡幼蟲組織切片(Du ZhM，1988)，固定劑用Carnoy 液或含0.25% TritonX－100的4% 多聚甲醛液(Yan et al.，2011)，切片厚4～6 μm。

1.2.2 組織學(xué)染色

1.2.2.1 HE 染色

二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ30 min，純乙醇Ⅰ、純乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、70%乙醇各3 min，自來水洗擦干，蘇木精染色10 min，自來水沖洗，酸酒精分色20 s，自來水沖洗，氨酒精藍(lán)化3 min，自來水沖洗，伊紅染色10 min，自來水沖洗，95% 乙醇分色，37℃烤片2 h，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2.2 PAS 染色

石蠟切片按1.2.2.1 的方法化蠟入水擦干后，過碘酸5 min，超純水洗兩遍，schiff 試劑(避光)30 min，超純水洗兩遍，部分切片經(jīng)蘇木精復(fù)染，超純水洗，37℃烤片2 h，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與討論

在多聚甲醛固定液中加入0.25% TritonX－100(Yan et al.，2011)或用Carnoy 固定液都適合于家蠅3齡幼蟲的固定，而且固定后切除部分表皮，使脫水和浸蠟等過程能夠順利完成，才能得到組織結(jié)構(gòu)完整、清晰的家蠅3齡幼蟲石蠟切片。冠狀面HE 染色顯示，家蠅3齡幼蟲體節(jié)明顯，組織結(jié)構(gòu)主要包括消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、血細(xì)胞、呼吸系統(tǒng)、表皮、肌肉和脂肪體等(圖1)。表皮、肌肉以及脂肪體是家蠅3齡幼蟲體壁的主要組成成分，較多成群分布的脂肪體細(xì)胞與其它器官一起分布于體腔中，血淋巴呈染成均質(zhì)的粉色。消化系統(tǒng)由腸道和唾液腺組成。腸道為縱貫體腔中央的長管狀結(jié)構(gòu)，從頭節(jié)口腔開始，止于腹節(jié)末端的肛門處，分為前腸、中腸和后腸三部分。切片顯示前腸由咽部、嗉囊、食道、前胃和胃盲囊組成，主要位于胸節(jié)，而中腸是腸道中最長的器官，故在腹節(jié)可見多個中腸切面，腹節(jié)末端可見后腸切面。唾液腺位于胸節(jié)，可延伸到第1～2 腹節(jié)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)位于胸節(jié)，可見對稱分布的腦組織。排泄系統(tǒng)主要是馬氏管，位于中腸和后腸周圍的體腔內(nèi)。血細(xì)胞大多集聚在3齡幼蟲尾部。呼吸系統(tǒng)主要由氣管及其分支構(gòu)成，開口于前后氣門。

圖1 家蠅3齡幼蟲冠狀面HE 染色全視圖Fig.1 General view of coronal plane of the third instar of Musca domestica with HE staining

2.1 腸道

家蠅3齡幼蟲的前腸包括咽部、嗉囊、食道、前胃和胃盲囊。咽部后方通過薄層扁平上皮與嗉囊相連接(圖2A)。嗉囊壁厚，可分為4～5 層(圖2B)，外膜為一層單層扁平上皮，胞質(zhì)強(qiáng)嗜堿性;內(nèi)有一層彈性膜，呈均質(zhì)嗜酸性的波浪狀;彈性膜內(nèi)為較厚的結(jié)締組織;PAS 染色顯示彈性膜與結(jié)締組織之間有一層梭形細(xì)胞，含豐富的糖原顆粒;內(nèi)層為單層立方或柱狀上皮，胞質(zhì)嗜堿性。嗉囊末端與食道相連(圖2C)，食道管壁主要由單層扁平上皮和平滑肌層構(gòu)成。食道末端內(nèi)陷入前胃，構(gòu)成一個特殊套管樣結(jié)構(gòu)(圖2D)，內(nèi)襯食道上皮和肌層，外被高錐形上皮;外表面是一層強(qiáng)嗜堿性上皮。前胃與中腸交匯處發(fā)出2 對細(xì)長的胃盲囊(圖2E)，胃盲囊上皮由單層細(xì)胞構(gòu)成，上皮起始部的細(xì)胞呈錐形，逐漸移行為立方形至矮柱狀。

中腸的不同部位，上皮的形態(tài)各異。中腸起始部的上皮為單層高圓錐形(圖2D，F(xiàn))，細(xì)胞核卵圓形居中，核染色質(zhì)疏松;PAS 染色中腸上皮腔面見紫紅色、整齊排列的紋狀緣(圖2F)。遠(yuǎn)離起始部的上皮細(xì)胞逐漸變?yōu)榘珗A錐形，甚至移行為單層扁平上皮，腸腔內(nèi)容物被圍食膜包裹(圖2G)。圍食膜為弱嗜堿性的薄膜狀結(jié)構(gòu)，與腸壁細(xì)胞間有一空隙，內(nèi)含上皮細(xì)胞生命活動的各種產(chǎn)物。

后腸可分為3個部分，幽門、回腸和直腸。幽門位于后腸與中腸交界處，即馬氏管匯入處，上皮向腸腔內(nèi)褶形成嵴(圖2H)，腸壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，可見卵圓形的細(xì)胞核，肌層較發(fā)達(dá)?；啬c組織結(jié)構(gòu)與幽門相似(圖2I)。直腸腸腔較窄，上皮無嵴狀突起，上皮細(xì)胞為立方形(圖2J)。

家蠅3齡幼蟲嗉囊和前胃的結(jié)構(gòu)是前腸中較特異的部分。石蠟切片HE 染色和PAS 染色顯示，嗉囊壁厚，又有彈性膜，說明嗉囊可以調(diào)節(jié)囊內(nèi)容物的容量，切片顯示的是空虛時(shí)的嗉囊壁厚腔小;其前端肌肉組織豐富，可能有防止食物反流至咽部的作用。前胃中央食道內(nèi)陷形成套管樣結(jié)構(gòu)、中腸不同區(qū)域上皮的組織結(jié)構(gòu)明顯不同、以及后腸分為幽門、回腸和直腸等研究結(jié)果與興義維蚋Wilhelmia xingyiense Chen and Zhang 成熟幼蟲消化道的結(jié)構(gòu)(Xun et al.，2011)相似。而回腸與胃盲囊的結(jié)構(gòu)與韭菜遲眼蕈蚊 Bradysia odoriphaga 幼蟲的組織學(xué)研究(Song et al.，2004)基本一致。家蠅3齡幼蟲中腸可見圍食膜，這為中腸上皮細(xì)胞免受食物顆粒的機(jī)械性損傷和以食物為載體的病原體的入侵提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(Zhang et al.，2009)。

2.2 唾液腺

圖2 家蠅3齡幼蟲石蠟切片F(xiàn)ig.2 Paraffin tissue sections of the third instar of Musca domestica

家蠅3齡幼蟲有一對單管泡狀的唾液腺(圖2K)，對稱分布于前腸及神經(jīng)組織的兩側(cè)。分泌部細(xì)胞近導(dǎo)管端為梭形，遠(yuǎn)離導(dǎo)管端為圓錐形，上皮細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)與研究人員(Lietze，et al.，2011)在透射電鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)相符合。而且還可清楚地辨別兩種嗜色性不同的細(xì)胞(圖2L)，嗜酸性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量紫紅色的酶原顆粒，嗜堿性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿嗜堿性顆粒，這為研究唾液腺的分泌細(xì)胞和非分泌細(xì)胞提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

2.3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)

家蠅3齡幼蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的構(gòu)成與果蠅(Gong and Liu，2011)的相似，也為腦－腹神經(jīng)索復(fù)合體(Sha et al.，2012)，主要由腦和腹神經(jīng)索組成(圖2M)。腹神經(jīng)索周邊神經(jīng)元較多(圖2N)，細(xì)胞核大而圓，核染色淺，核仁明顯(圖2O)，中央主要是神經(jīng)元突起所在的部位，染成粉紅色。

2.4 馬氏管

家蠅3齡幼蟲有2 條細(xì)長的馬氏管，末斷游離于消化道周圍，近端匯入中腸與后腸分界處(圖2H)，馬氏管上皮由單層細(xì)胞圍成(圖2P)，細(xì)胞核大，卵圓形，凸向腔面，細(xì)胞質(zhì)豐富，PAS 染色上皮游離面紋狀緣明顯(圖2Q)，這些組織結(jié)構(gòu)與學(xué)者們對家蠅馬氏管的電鏡研究相符合(Sohal，1974)，為證明馬氏管上皮也具有吸收功能提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。

2.5 血細(xì)胞

HE 染色的石蠟切片中家蠅3齡幼蟲的血細(xì)胞的形態(tài)清楚，分為原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞以及類絳血胞5類(圖2R)。原血胞較小，呈圓形，細(xì)胞核大而圓，胞質(zhì)很少。漿血胞大小不一，圓形或卵圓形，細(xì)胞核圓形，核染色質(zhì)致密，沿核的中心向四周呈輻射狀分布，形似車輪狀，這是漿血胞s 的典型特征，胞質(zhì)豐富，強(qiáng)嗜堿性。粒血胞圓形或卵圓形，細(xì)胞核染色淺，輪廓不清楚，胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的嗜堿性顆粒，顆?？筛采w在細(xì)胞核上。珠血胞體積較大，細(xì)胞核圓形或卵圓形，染色淺，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含大量嗜堿性顆粒，顆粒大小一致，分布均勻。類絳血胞體積最大，且大小不一，多為圓形，核圓居中，胞質(zhì)充滿粗大的嗜酸性顆粒，顆粒折光性強(qiáng)，較大的類絳血胞細(xì)胞壁容易破裂。家蠅幼蟲血細(xì)胞HE 染色的特點(diǎn)與體外熒光染色(Liu et al.，2008)的形態(tài)特征互為補(bǔ)充。

2.6 氣管及其分支

家蠅3齡幼蟲的呼吸系統(tǒng)由氣管及分支形成的支氣管樹構(gòu)成，終端開口于前、后氣門。各級氣管分支的組織結(jié)構(gòu)與氣管相同，只是管腔逐漸變小，管壁逐漸變薄。氣管上皮為單層扁平上皮(圖2S)，與電鏡下微氣管(Lietze et al.，2011)的結(jié)構(gòu)相似，胞質(zhì)較少，強(qiáng)嗜堿性，細(xì)胞核卵圓形，上皮腔面有一層嗜酸性均質(zhì)狀的內(nèi)膜，形如柵欄狀。

2.7 表皮、肌組織及脂肪體

表皮由淺表的幾丁質(zhì)層和深部的表皮細(xì)胞構(gòu)成(圖2S)。幾丁質(zhì)層厚，呈嗜酸性，且越接近體表嗜酸性越強(qiáng);表皮細(xì)胞為單層錐形，胞質(zhì)強(qiáng)嗜堿性。表皮內(nèi)側(cè)有較多骨骼肌，可見明顯的橫紋(圖2T)，體腔內(nèi)有大量脂肪體，由多邊形的多泡脂肪細(xì)胞構(gòu)成，其組織結(jié)構(gòu)與致倦庫蚊(Yan et al.，2011)的相似。。PAS 染色顯示，表皮細(xì)胞、骨骼肌纖維和脂肪體細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)均可見染成紫紅色的糖原顆粒(圖2A，T)。糖原是動物和細(xì)菌內(nèi)糖的貯存形式，還含有多糖合成和代謝的酶等，多以顆粒形式貯存于肝和肌肉的細(xì)胞質(zhì)中。昆蟲的脂肪體相當(dāng)于其它動物的肝臟。家蠅的肌組織、脂肪體和表皮細(xì)胞貯存的糖原為家蠅在復(fù)雜條件下的生命活動提供了能量儲備。

本研究為家蠅3齡幼蟲石蠟切片的制作方法提供了參考，并獲得了家蠅3齡幼蟲較系統(tǒng)和全面的組織學(xué)資料。這些研究結(jié)果為蠅類的分類和防治提供了形態(tài)學(xué)資料，也為進(jìn)一步應(yīng)用原位雜交和免疫組織化學(xué)技術(shù)研究家蠅功能分子(Zhang et al.，2013)的表達(dá)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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