左歸丸逆轉Th1／Th2亞群偏移減輕雌激素缺乏骨丟失＊

謝寶華 鞠紅梅 王 麗 周憲賓 郭鈺琪 李 霞△

（1濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，山東 濟南250062；2濟寧醫學院基礎學院，山東 濟寧272067；3山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南250011）

正常骨代謝是成骨細胞（OB）與破骨細胞（OC）參與的骨形成和骨吸收的動態平衡過程，此過程受內分泌、免疫系統調節；內分泌—免疫—骨代謝網絡失衡會導致多種骨代謝性疾病發生，如成骨不全、骨質疏松癥（OP）等，嚴重危害患者健康。雌激素是人體重要的性激素，研究發現絕經后骨質疏松發病率隨著年齡的增長而增高，并與雌二醇水平呈負相關［1］。T細胞是機體免疫系統中重要的細胞群體，Th1、Th2是經典的T細胞亞群，生理條件下，機體的Th1和Th2細胞處于平衡狀態，如果Th1／Th2的極化發生偏移容易誘發病理改變［2］。雌激素—T細胞—骨代謝三者的關系成為本領域研究的焦點問題。我們前期研究證實骨密度與雌激素水平及T細胞亞群相關細胞因子表達存在顯著相關性［3］。補腎經典方劑左歸丸治療骨代謝疾病效果顯著，研究發現左歸丸可明顯改善Th1／Th2的漂移狀態，顯著提高Th2細胞因子IL－10的表達，逆轉Th1優勢［4］。本研究以逆轉Th1／Th2亞群偏移為切入點，探討雌激素缺乏導致的T細胞亞群偏移與骨代謝的相關性，闡釋左歸丸逆轉Th1／Th2亞群偏移狀態減輕雌激素缺乏骨丟失的作用與機制，為指導臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2010年1月至2012年11月在山東中醫藥大學附院查體的自然絕經婦女30例，年齡45～65歲，平均（55.93±5.61）歲，絕經時間最長18a，最短3a，隨機分為絕經組與中藥組，各15例。選取同期在婦科及骨科門診查體的健康未絕經婦女15例，年齡25～45歲，平均（35.30±6.22）歲，平素月經規律，身體健康，未妊娠，納入未絕經組。3組均排除其它影響骨代謝的疾病，未用雌激素替代治療及其它治療。本研究經山東中醫藥大學附院倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 左歸丸提取制備

采用水提、醇溶法提取左歸丸溶液，左歸丸由熟地黃、山藥、枸杞、山茱萸、鹿角膠、龜板膠、川牛膝、菟絲子按8∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶3配伍，煎煮濾取藥液，加入烊化的龜板膠和鹿角膠，水浴濃縮，依次加入65%、75%、85%乙醇，沉淀過夜，濾取上清，水浴減壓法回收乙醇，獲取左歸丸溶液。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 空腹采集研究對象靜脈血4ml，其中1.5ml離心后取血清，電化學發光法檢測血清雌二醇（E2）水平；剩余2.5ml采用EDTA抗凝，Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞（PBMC），用于流式、Western blot及RT－PCR檢測。

1.3.2 主要試劑 E2檢測試劑盒購于德國羅氏公司；M－MLV購于Fermentas公司；RNA抑制劑購于上海生工生物有限公司；Ionomycin、PMA購于Sigma公司；DEPC、GIT、L－Gln購于AMRESCO公司；FBS購于杭州四季青生物公司；RPMI Medium 1640購于GIBCO公司。

1.3.3 流式細胞術檢測 分離靜脈血制備單個核細胞懸液，PBS洗2遍，用1640培養液調整細胞濃度為1×107／ml，接種于24孔板（1ml／孔），分別加入PMA 30ng／ml、Ionomycin 1μg／ml、Monensin 1.7μg／ml，37℃5%二氧化碳刺激培養4h后，收集培養細胞，PBA（PBS＋0.1%NaN3＋0.1%BSA）洗兩遍，重懸于PBA緩沖液，按說明書加入CD4－FITC和CD3－Cy5熒光抗體，4℃避光染色30min，PBA清洗3遍，加入100μl固定液，4℃，避光固定30min；穿膜液清洗1次，重懸于100μl穿膜液中，加入新鮮小鼠血清20μl／管，4℃，避光封閉30min；分別加入PE標記的TNF－α、IL－4熒光抗體，室溫避光染色1h，用穿膜液和PBA各洗1遍后重懸于PBA中，用于流式細胞術胞內外因子的檢測。

1.3.4 Western blot法檢測T細胞亞群特異性核轉錄因子蛋白水平 RIPA裂解液裂解PBMC蛋白，高速離心：12000g離心30min，吸取上清蛋白，混勻，沸水中煮3min，取出，12000g離心1min，取上清；電泳分離轉膜；25ml TBS洗膜5min，室溫，搖動；置膜于25ml封閉緩沖液中1h，室溫，搖動，15ml TBS／T洗3次（5min／T）；加入1∶250稀釋的T－bet、GATA3一抗，室溫孵育1h，緩慢搖動；15ml TBS／T洗3次（5min／T）；加入1∶1000辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動，15ml TBS／T洗3次（5min／T），15ml TBS洗1次；化學發光法檢測蛋白表達。

1.3.5 RT－PCR檢測T細胞亞群特征性細胞因子轉錄水平 RNA提取：采用異硫氰酸胍一步法提取PBMC總mRNA，紫外分光光度儀檢測A260／A280比值，驗證RNA濃度和純度。RT反應：采用oligo dT為RT反應引物，取2.5μg總RNA按RT試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA 20μl；PCR反應：總反應體系為25μl，包含RT產物5μl，10×PCR buffer 2.5μl，25mM MgCl22μl，上下 游 引 物 各0.25μl（25pmol），10mM DNPT 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，DEPC水14μl。反應條件為95℃預變性5min，94℃1min，58～60℃1min，72℃1min，26個循環后，70℃延長10min。1.5%凝膠（EB染色）水平電泳，采用Alpha凝膠成像系統分析圖像：以β－actin為內參照，計算目的基因與同步β－actin灰度值比值作為相對表達量。

1.3.6 腰椎骨礦物質密度（BMD）測定 研究對象平躺在測量床上，雙能X線骨密度儀測定研究對象腰椎2～4（L2～4）前后位BMD。

1.4 統計學方法

所有實驗數據采用SPSS 11.5軟件做統計學處理，計量資料以±s表示。采用One Way－ANOVA方差分析，兩組間比較采用Turkey法檢驗，數據間相關性用Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 血清E2水平比較

未絕經組血清E2平均為（91.11±10.01）pg／ml，絕經組平均為（33.73±7.12）pg／ml，中藥組平均為（37.09±6.23）pg／ml。與未絕經組比較，絕經后婦女血清E2水平明顯降低（t＝18.092，P＜0.05）；與絕經組比較，中藥組絕經婦女E2表達無顯著性差異（t＝1.374，P＞0.05），表明左歸丸對絕經婦女E2表達無影響，無明顯雌激素樣作用。見圖1。

圖1 血清E2水平比較

2.2 腰椎L2～4BMD比較

未絕經組L2～4BMD平均為（1.28±0.07）g／cm2，絕經組平均為（0.87±0.14）g／cm2，中藥組平均為（1.10±0.16）g／cm2。與未絕經組相比，絕經后婦女腰椎BMD明顯降低（t＝10.559，P＜0.05）；與絕經組比較，中藥組絕經婦女腰椎BMD明顯升高（t＝4.304，P＜0.05），見圖2。

圖2 腰椎2～4骨密度比較

2.3 Th1／Th2亞群比例比較

與未絕經組相比，絕經組Th1亞群比例明顯升高（t＝5.760，P＜0.05），Th2亞群比例明顯降低（t＝3.605，P＜0.05），T細胞向Th1亞群偏移。與絕經組相比，中藥組絕經婦女Th1亞群比例明顯降低（t＝3.128，P＜0.05），Th2亞群比例明顯升高（t＝2.424，P＜0.05）。見圖3。

圖3 Th1／Th2亞群比例比較

2.4 E2、骨密度、Th1／Th2亞群比例相關性分析

相關性分析顯示E2表達與骨密度呈顯著正相關（P＜0.05）；骨密度與Th1亞群比例呈顯著負相關（P＜0.05），與Th2亞群比例呈顯著正相關（P＜0.05）；E2表達與Th1亞群比例呈顯著負相關（P＜0.05），與Th2亞群比例呈顯著正相關（P＜0.05），見表1。

表1 E2、BMD與Th1／Th2亞群比例的相關性分析

2.5 Th1／Th2亞群特異性核轉錄因子（T－bet、GATA－3）蛋白表達比較

與未絕經組比較，絕經組Th1亞群特異性核轉錄因子（T－bet）蛋白表達明顯升高（t＝4.343，P＜0.05），Th2亞群特異性核轉錄因子（GATA－3）蛋白表達明顯降低（t＝4.721，P＜0.05）；與絕經組比較，中藥組絕經婦女T－bet蛋白表達明顯降低（t＝3.086，P＜0.05），GATA－3蛋白表達明顯升高（t＝3.535，P＜0.05）。見圖4。

圖4 T－bet、GATA－3蛋白表達比較

2.6 Th1／Th2亞群特征性細胞因子（TNF－α、IL－4）mRNA表達比較

與未絕經婦女比較，絕經后婦女Th1亞群特征性細胞因子（TNF－α）mRNA相對灰度值明顯升高（t＝4.557，P＜0.05），Th2亞群特征性細胞因子（IL－4）mRNA相對灰度值明顯降低（t＝4.669，P＜0.05）；與絕經婦女相比，中藥組絕經婦女TNF－αmRNA相對灰度值明顯降低（t＝3.092，P＜0.05），IL－4mRNA相對灰度值明顯升高（t＝4.257，P＜0.05）。見圖5。

圖5 TNF－α、IL－4mRNA表達比較

3 討論

初始T細胞遇抗原刺激后在特異性核轉錄因子與分化誘導因子作用下，分化為不同亞群，分泌特征性細胞因子，介導不同的免疫反應，對骨代謝發揮正向和負向調控作用。RANKL是OC分化的關鍵調控因子，其受體是位于OC上的RANK，RANKL與RANK結合，啟動OC的分化、成熟和活化過程［5］。Th1、Th2是經典的T細胞亞群。Th1類細胞因子TNF－α被稱為溶骨性細胞因子，是一種多功能的炎癥介質，可通過誘導OB表達RANKL，間接促進OC分化、成熟，也可直接促進RANKL誘導的OC形成和骨吸收［6］。Th2類細胞因子IL－4能抑制RANKL誘導的生理性骨吸收和病理情況下TNF－α誘導OC生成，體外研究顯示IL－4一定條件下能抑制破骨細胞前體向OC分化及抑制成熟OC的活性，同時IL－4還抑制OC的RANK表達［7］。因此，影響T細胞極化的因素均可影響T細胞亞群細胞因子的表達，從而影響骨代謝。隨著對神經—內分泌—免疫網絡研究的不斷深入，發現雌激素對T細胞亞群極化有重要調節作用。雌激素是重要的性激素，E2是女性和男性雌激素主要來源。衰老、應激、過度體力活動、低體重等狀態均可出現雌激素缺乏，導致OP等骨代謝疾病發生，說明雌激素缺乏對骨代謝有重要影響。研究發現，T細胞上存在雌激素受體，雌激素水平變化可直接影響T細胞增殖、活化和極化，雌激素缺乏可誘導T細胞向Th1漂移，導致T細胞亞群失衡［8］。因此推斷雌激素—T細胞—骨代謝三者間有密切的聯系。臨床上，雌激素替代及免疫調節療法治療骨代謝性疾病有確切療效，但存在誘發子宮內膜癌、宮頸癌、乳腺癌、代謝紊亂、感染等危險，且不適用于男性骨代謝疾病患者。因次，尋找能夠逆轉或改善雌激素缺乏誘導的T細胞亞群極化、糾正骨代謝失調，又無雌激素樣及免疫治療副作用的藥物具有良好的應用前景。

中醫認為“腎主骨生髓”。現代醫學研究發現中醫“腎”的功能覆蓋了神經、內分泌、免疫系統，構成了完整的人體調節網絡，腎虛可導致神經—內分泌—免疫網絡功能失調，引起骨代謝疾病發生［9］。以補腎法為原則治療骨代謝疾病療效確切。研究證實補腎中藥能促進OB增殖，抑制OC形成，上調骨組織I型膠原和骨礦化相關蛋白表達，減少尿鈣排泄，升高大鼠骨密度［10］。補腎經典方劑左歸丸治療OP等骨代謝疾病效果顯著，可通過調節OB中RANKL表達實現對OC的抑制［11］。中藥免疫藥理研究證實左歸丸能調節卵巢早衰雌激素缺乏小鼠CD4＋／CD8＋亞群平衡，改善卵巢早衰小鼠免疫功能［12］。但尚未見對左歸丸及其它補腎方劑逆轉或改善雌激素缺乏誘導的T細胞亞群極化異常調節骨代謝的研究報道。

本研究顯示，婦女絕經后血清E2水平與骨密度均明顯降低、Th1亞群比例升高、Th2亞群比例降低；血清E2表達與骨密度呈正相關；骨密度、E2表達與Th1亞群比例呈負相關，與Th2亞群比例呈正相關。此結果進一步證實雌激素缺乏狀態誘導Th1／Th2亞群向Th1偏移，且與骨密度降低關系密切。同時絕經婦女T－bet蛋白表達、TNF－α mRNA表達升高，GATA－3蛋白表達、IL－4mRNA表達降低，表明雌激素缺乏狀態下，促進骨吸收細胞因子表達升高，導致骨密度下降。絕經婦女服用左歸丸后，血清E2水平無明顯變化，表明左歸丸對機體無明顯雌激素樣作用；骨密度、Th2亞群比例升高，Th1亞群比例降低，T－bet蛋白表達、TNF－αmRNA表達降低，GATA－3蛋白表達、IL－4 mRNA表達升高，表明左歸丸通過下調T－bet蛋白表達、上調GATA－3蛋白表達，誘導T細胞向Th2亞群分化，進而抑制TNF－αmRNA與蛋白表達、促進IL－4mRNA與蛋白表達，抑制骨吸收，升高骨密度。綜合以上研究結果，雌激素缺乏導致的Th1／Th2亞群向Th1偏移是骨丟失發生的原因；中藥方劑左歸丸通過干預T細胞亞群特異性核轉錄因子表達，逆轉雌激素缺乏導致的Th1／Th2亞群偏移，抑制骨吸收細胞因子產生，促進骨形成細胞因子表達，從而減少骨丟失，促進骨形成。

［1］ 李恩，閆素云，谷麗敏，等.原發性骨質疏松發病的相關因素［J］.中國骨質疏松雜志，1997，3（2）：1－3.

［2］ 何維.醫學免疫學［M］.北京：人民衛生出版社，2005：197－198.

［3］ 李霞，孫建麗，王彬，等.絕經婦女外周血單個核細胞骨代謝調控因子表達變化［J］.中國免疫學雜志，2011，8：49－53.

［4］ 姚成芳，王麗.陰虛陽亢小鼠Th1／Th2類細胞因子的漂移現象及中藥左歸丸的干預研究［J］.山東大學學報，2004，42（3）：349－352.

［5］ Varenna M，Gatti D.The role of rank－ligand inhibition in the treatment of postmenopausal osteoporosis［J］.Reumatismo，2010，62（3）：163－171.

［6］ Fuller K，Murphy C，Kirstein B，et al.TNF alpha potently activates osteoclasts，through a direct action independent of and strongly synergistic with RANKL［J］.Endocrinology，2002，143：1108－1118.

［7］ Moreno JL，Kaczmarek M，Keegan AD，et al.IL－4suppresses osteoclast development and mature osteoclast function by a STAT6－dependent mechanism：irreversible inhibition of the differentiation program activated by RANKL［J］.Blood，2003，102（3）：1078－1086.

［8］ Wilder RL.Adrenal and gonadal steroid hormone deficiency in the pathogenesis of rheumatoid arthritis［J］.J Rheumatol Suppl，1996，44：10－12.

［9］ 楊裕華，李震.補腎中藥對腎陽虛動物模型神經內分泌免疫系統影響的實驗研究進展［J］.天津中醫藥，2007，24（3）：262－264.

［10］李恩，孔德娟.補腎方藥對骨質疏松防治的實驗研究［J］.中國骨質疏松雜志，2002，8（2）：166－170.

［11］劉梅潔，鞠大宏.“腎主骨”的機理研究－左歸丸含藥血清對破骨細胞分化調控因子OPG、RANKL蛋白表達的影響［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2009，5（3）：184－188.

［12］Shen JJ，Lin CJ.The effect of liu－wei－di－huang wan on cytokine gene expression from human peripheral blood lymphocytes［J］.Am J Chin Med，2003；31（2）：247－257.