EBVaGC中LMP1和BHRF1的表達與血管生成淋巴管生成的關(guān)聯(lián)性研究

張 偉 王愛亮 崔 凱 孫 靜 李 勝△

（1濟南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南250062；2山東省腫瘤防治研究院，濟南250117；3濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟寧272029）

EB病毒（Epstein－Barr virus，EBV）與人類多種惡性腫瘤有關(guān)，例如Burkitt淋巴瘤（BL）、Hodokin病（HD）、鼻咽癌（NPC）及胃癌（GC）等［1］，胃癌細胞內(nèi)存在EBV者定義為EBV相關(guān)性胃癌（EBVaGC）。EB病毒潛伏膜蛋白基因（LMP1）和EB病毒早期編碼基因（BHRF1）是公認的病毒致癌基因，EBV編碼的BHRF1蛋白在約90%EBVaGC組織中可檢測到，但未發(fā)現(xiàn)LMP1的表達［2－3］。因此，我們收集EBV相關(guān)胃癌組織，利用免疫組化方法檢測LMP1、BHRF1、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF－C）、淋巴細胞內(nèi)皮標(biāo)記物（LYVE－1）和高度糖基化的i型跨膜糖蛋白（CD34）的表達情況，探討與臨床病理的關(guān)系，從而初步了解其在EBVaGC中發(fā)生的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有患者均來自山東省籍貫并且三代居住在山東省內(nèi)的當(dāng)?shù)貪h族人群。所有病例均取自山東省腫瘤防治研究院和濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2008年至2012年的手術(shù)標(biāo)本，采用標(biāo)本均簽署知情同意書。胃癌手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本600例（含石蠟包埋組織），選取經(jīng)原位分子雜交檢測鑒定EB病毒相關(guān)性胃癌30例。

1.2 方法

1.2.1 病理標(biāo)本處理 標(biāo)本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定、石蠟包埋。所有標(biāo)本均以4μm連續(xù)切片，LMP1、BHRF1、VEGF－C、LYVE－1和CD34單克隆抗體按1∶200稀釋，以下操作步驟按試劑盒說明進行，最后DAB（二氨基聯(lián)苯胺）顯色，常規(guī)復(fù)染封片。用已知的陽性切片作陽性對照，以PBS代替上述抗體作陰性對照。其中一張用蘇木精－伊紅染色，光鏡觀察進行組織病理學(xué)分類。

1.2.2 免疫組織化學(xué)（SP法） 我們應(yīng)用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素（Streptavidin Peroxidase，SP）免疫細胞化學(xué)方法對上述標(biāo)本中LMP1、BHRF1、VEGF－C、LYVE－1和CD34的表達水平進行檢測。

1.2.3 試劑 LMP1、BHRF1、VEGF－C、LYVE－1和CD34單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限 公 司（DAKO Cytomation，Glostrup，Denmark），均為濃縮型產(chǎn)品。S－P試劑盒購自福州邁新公司。用已知的乳腺癌標(biāo)本作為陽性對照，PBS（磷酸鹽緩沖液）代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 結(jié)果判定 閱片由兩位病理科醫(yī)師分別雙盲閱片，LMP1、BHRF1、VEGF－C均以細胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞信號；VEGF－C以細胞膜和／或胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。每例切片至少計數(shù)10個400倍視野，計數(shù)陽性細胞占所有細胞的百分數(shù)，陽性細胞數(shù)＞25%為陽性，以陽性細胞數(shù)所占比例分為：＜10%（－），11%～25%（＋），25%～50%（?），＞50%（?）。染色強度判定：不著色（－），淺棕黃色（＋），棕黃色（?），棕褐色（?）。綜合陽性細胞數(shù)和染色強度對染色結(jié)果進行分析。

采用抗CD34多克隆抗體標(biāo)記微血管內(nèi)皮細胞，其標(biāo)記的微血管的結(jié)果判定如下：先在低倍（×100倍）鏡下全面觀察切片，尋找微血管高密度區(qū)，在400倍視野下，以與周圍腫瘤細胞和結(jié)締組織成分有明顯區(qū)別的、任何一個染成棕黃色的內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇作為一個微血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也作為一個血管進行計數(shù)；但管腔＞8個紅細胞大小或帶有肌層的血管均不計數(shù)。記錄5個高倍視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均值作為每例的微血管密度（MVD）。

同樣通過免疫組織化學(xué)方法顯色，微淋巴管在光鏡下為棕黃色細長管壁包繞的條索狀或不規(guī)則形的管腔，以抗LYVE－1單克隆抗體標(biāo)記微淋巴管內(nèi)皮細胞，其標(biāo)記的微淋巴管的結(jié)果判定如下：在低倍鏡（×100倍）下尋找LYVE－1陽性脈管密集區(qū)，換高倍鏡（×400倍）選取5個視野計數(shù)，取其平均值計算微淋巴管密度（MLVD）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 3種EBVaGC臨床病理因素不同水平的LMP1、BHRF1、VEGF－C的表達比較及MVD和MLVD量的比較

LMP1位于細胞膜上及胞漿中，呈棕色顆粒狀分布，胞核陰性，30例EBVaGC中6例弱陽性，陽性率為20%。BHRF1位于細胞膜上及胞漿中，呈棕色顆粒狀分布，30例EBVaGC中20例呈陽性，陽性率為66.67%。VEGF－C表達陽性在鏡下均表現(xiàn)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，19例陽性，陽性率為63.33%。

免疫組織化學(xué)染色中CD34主要定位于微血管內(nèi)皮細胞，組織中微血管形態(tài)不規(guī)整，分布不均；癌灶邊緣血管較密集，成簇狀，部分呈發(fā)芽狀，管腔相對規(guī)則，但微血管分布不均。

微淋巴管在光鏡下為棕黃色細長管壁包繞的條索狀或不規(guī)則形的管腔，LYVE－1主要表達在癌巢周圍間質(zhì)脈管內(nèi)皮細胞。癌巢組織內(nèi)的淋巴管分布少，且管徑小；癌旁周圍組織淋巴管分布相對于癌巢內(nèi)多，呈不規(guī)則形，并且有大量的淋巴細胞浸潤。MLVD陽性脈管多呈管腔狀、條索狀彌漫或散在分布在癌巢周圍間質(zhì)，常可見癌細胞浸潤。

LMP1在30例EBVaGC中6例陽性，陽性率為20%。不同TNM分期的LMP1蛋白表達陽性率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），有無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LMP1蛋白表達陽性率的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。BHRF1有20例陽性，陽性率為66.67%，不同TNM分期的BHRF1表達陽性率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。有無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的BHRF1表達陽性率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示BHRF1表達和TNM分期級、有無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)。VEGF－C 19例陽性，陽性率為63.33%，有無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的VEGF－C蛋白的表達陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示VEGF－C蛋白的表達與EBVaGC的周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）有關(guān)聯(lián)（表1）。

2.2 形態(tài)計量學(xué)圖像分析法測定MVD、MLVD結(jié)果比較

EBVaGC中MVD在不同性別、有無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而在不同的TNM分期之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。形態(tài)計量學(xué)圖像分析法測定MLVD發(fā)現(xiàn)，EBVaGC中MLVD在不同TNM分期和有無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

2.3 BHRF1和VEGF－C的表達與MVD及MLVD之間的關(guān)系

30例EBVaGC組織中BHRF1陽性表達者的MVD與陰性組無差別，說明BHRF1的表達與MVD無統(tǒng)計學(xué)的關(guān)聯(lián)，而與MLVD有統(tǒng)計學(xué)的關(guān)聯(lián)。在VEGF－C陽性表達的19例EBVaGC組織中，MVD和MLVD均明顯高于陰性組，兩組比較其差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，說明VEGF－C可能參與EBVaGC的血管和淋巴管生成，其高表達間接促進腫瘤細胞沿新生的淋巴管遷徙和轉(zhuǎn)移（表3）。

表1 3種EBVaGC臨床病理因素不同水平的LMP1、BHRF1和VEGF－C表達比較

表2 3種EBVaGC臨床病理因素不同水平的MVD和MLVD比較（±s）

表2 3種EBVaGC臨床病理因素不同水平的MVD和MLVD比較（±s）

臨床病理因素 n MVD t P MLVD t P性別 男54.91±5.84女16 14 57.08±6.42 0.97 0.3402 6.22±4.08 8.17±2.12 1.6 0.1198 TNM分期 Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ13 17 52.28±5.83 58.71±4.82 －3.31 0.0026 4.67±3.10 9.02±2.26 －4.45 0.0001淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性陽性9 54.14±6.69 21 56.69±5.85 －1.05 0.3040 4.98±3.49 8.06±2.99－2.46 0.0205

表3 不同BHRF1和VEGF－C水平MVD、MLVD表達情況的比較（±s）

表3 不同BHRF1和VEGF－C水平MVD、MLVD表達情況的比較（±s）

n MVD t P MLVD t P BHRF1表達 陰性陽性10 20 29.00±15.08 0.31 0.7625 4.72±1.79 8.95±3.63 30.60±9.49－3.46 0.0018 VEGF－C表達 陰性陽性11 19 36.09±10.80 －4.63＜0.0001 4.59±1.75 8.99±3.73 18.20±9.04－3.67 0.001

3 討論

EBVaGC是一個新出現(xiàn)的概念，因胃癌細胞中存在EB病毒而得名。據(jù)估計，全球每年新增EBVaGC患者多于80萬人［4］，而全球10%的胃癌病例被證實與EB病毒相關(guān)［5］。EBVaGC在臨床上表現(xiàn)為以男性為主，發(fā)病年齡較小，多發(fā)生在胃上部和胃體部，腫瘤直徑較小。EBVaGC較少發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，5年存活率可達66.2%，比EB病毒非相關(guān)性胃癌（EBVnGC）高［6］。

LMP1是EB病毒編碼的一種6次跨膜蛋白，與細胞粘附性改變、細胞外基質(zhì)降解和腫瘤血管生成等均有密切的聯(lián)系［7］。EBVaGC為I型潛伏感染，表達EBNA1，EBERs和BARF0，部分病例表達LMP2A4種I型潛伏感染基因，而不表達LMP1和EBNA2［8］。本次實驗結(jié)果顯示在30例EBVaGC中6例呈弱陽性（陽性率20%），與性別、分期及有無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面無統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，說明在EBVaGC中LMP1呈低表達，對EBVaGC發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移作用有限。

BHRF1屬EB病毒早期抗原，在EB病毒溶解復(fù)制周期的早期大量表達，和Bcl－2具有部分相同的蛋白序列，可能與Bcl－2一樣能延緩細胞的終末分化，增加抵抗DNA損傷藥物和促進細胞在無血清情況下生存，從而抑制細胞凋亡［9］。在本次試驗中，我們通過對30例EBVaGC標(biāo)本的免疫組化染色證實，BHRF1在30例EBVaGC中20例陽性（陽性為66.67%），其高表達與TNM分期和周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，表明BHRF1高表達可能促進EBVaGC病情進展。

本文通過形態(tài)計量學(xué)圖像分析法測定MLVD，發(fā)現(xiàn)在EBVaGC中MLVD與TNM分期和周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切（表2），而20例BHRF1陽性患者與10例BHRF1陰性患者中MLVD平均值亦存在顯著差異，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況吻合。但形態(tài)計量學(xué)圖像分析法測定的MVD與TNM分期顯著相關(guān)，而與性別、周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。因此，根據(jù)實驗結(jié)果，我們推論EBVaGC較少發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與BHRF1的高表達可能抑制EBVaGC周圍淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。

通過免疫組化與組織學(xué)觀察對EBVnGC（EB病毒非相關(guān)性胃癌）與EBVaGC病理切片進行比較，結(jié)果表明EBVnGC組織中微血管形態(tài)不規(guī)整，分布不均，以癌腫邊緣為主，而EBVaGC腫瘤微環(huán)境中，微血管和微淋巴管的增生較少，因而可能減少其淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，該發(fā)現(xiàn)與臨床EBVaGC較少發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亦相符。

VEGF－C是新近鑒定出的淋巴管生長因子，也是酪氨酸激酶受體（VEGFR－3／fit－4）的特異性配體，能通過選擇性地誘導(dǎo)淋巴管生成促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移播散［10］。

目前關(guān)于VEGF－C的研究在鼻咽癌等頭頸部腫瘤中已較為深入，大量研究提示其表達與淋巴轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［11］，EBV編碼的LMP1蛋白可以通過直接或間接的方式上調(diào)VEGF－C的表達，從而對鼻咽癌的淋巴轉(zhuǎn)移及發(fā)生發(fā)展起到促進作用［12］。而本次實驗以胃癌患者為研究對象，在EBVaGC標(biāo)本中對比19例VEGF－C陽性標(biāo)本和11例VEGF－C陰性標(biāo)本的微血管和微淋巴管生成情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19例VEGF－C陽性表達EBVaGC中，MVD和MLVD均明顯高于陰性組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示VEGF－C表達水平的上調(diào)可能與微血管和微淋巴管增生關(guān)系密切（表3），可能參與EBVaGC的血管和淋巴管生成，其高表達間接促進腫瘤細胞沿新生的淋巴管遷徙和轉(zhuǎn)移。

目前已知在鼻咽癌中LMP1存在高表達，它與VEGF的表達和鼻咽癌的侵襲性、血管生成密切相關(guān)。而在本研究中發(fā)現(xiàn)EBVaGC中存在LMP1低表達和BHRF1高表達，與鼻咽癌存在差異。而EBVaGC和NPC中侵襲性、血管生成和淋巴管生成的差異是否與LMP1和BHRF1的表達差異有關(guān)，LMP1和BHRF1的表達在EBVaGC和NPC發(fā)生發(fā)展過程中的作用，甚至以及EBVaGC和NPC中的侵襲性、血管生成和淋巴管生成關(guān)系等分子機理等，仍有待進一步研究。

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