替莫唑胺對U251干細胞細胞周期及細胞增殖的影響＊

李根華 張 浩 劉 陽 孔令勝 馬輝福 靳 峰

（濟寧醫學院附屬醫院，山東 濟寧272029）

多形性膠質細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是中樞神經系統最常見的原發腫瘤，即使采用多種治療手段，包括手術、放療和化療，其預后仍極差，生存時間小于12個月［1］。盡管近期研究顯示，以替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）為基礎的放化療能使患者病情得到明顯的改善，但經此類治療的患者無進展期生存時間僅有7.9個月，全期生存時間也僅有14.6個月［2］。我們實驗的主要目的是研究化療藥物TMZ對膠質瘤U251細胞及其干細胞的細胞周期的影響，找出TMZ抑制腫瘤細胞及干細胞增殖的規律，為膠質瘤的治療提供新的方法和思維。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

膠質瘤細胞U251來源于人腦多形性膠質母細胞瘤，購買于中國典型培養物保藏中心；改良Eagle培養基（DMEM／F12）（1∶1）培養基購自Hyclone公司；胎牛血清PI試劑盒購自杭州四季青公司；表皮生長因子（EGF）；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），白血病抑制因子（LIF）均購自美國Pepro Tech公司；胰蛋白酶（trypsin）；B27由Gibco公司生產；兔抗人CD133抗體；免疫磁珠（CD133＋）細胞分選試劑盒為德國Miltenyi Biotec公司產品；CCK－8試劑盒購于日本同仁化學研究所；Multiskan酶標儀為Thermo公司產品。

1.2 細胞培養方法

1.2.1 血清培養基 U251細胞在含有10%胎牛血清、青霉素100U／ml和鏈霉素100μg／ml的DMEM／F12培養基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中連續培養。

1.2.2 無血清培養基 選取對數生長期的U251細胞，0.25%胰蛋白酶消化5min，10%胎牛血清培養基中和終止消化，滴管反復輕輕吹打貼壁細胞使其脫落成單細胞懸液，收集單細胞懸液至試管，1000r／min，離心5min，棄掉上清液，DMEM／F12重懸細胞漂洗1遍，1000r／min，離心5min，棄掉上清液，收集細胞接種到含有EGF（20ng／ml）、bFGF（20ng／ml）、LIF（10ng／ml）、B27（1×）的DMEM／F12無血清培養基中［3－4］，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中連續培養，待其培養7～9d，形成細胞球樣細胞球，胰酶消化后，200目濾網過濾制成單細胞懸浮液，計數后參照課題組之前使用免疫磁珠試劑盒分選方法［5］，加入CD133試劑，4℃孵育30min，分選出CD133＋細胞，并將分選出的細胞用無血清培養基培養。

1.3 細胞增殖活性及TMZ細胞毒性檢測

按照實驗設計分組，提前24h在96孔板接種U251細胞10000個／孔，U251干細胞10000個／孔，次日吸掉96孔板培養基后按上述設計每孔加100μl配制的TMZ培養基（U251為血清培養基＋TMZ，U251干細胞為干細胞培養基＋TMZ），TMZ濃度分別為空白對照、25μmol／L、50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L、400μmol／L（空白對照為DMSO代替TMZ），每孔設2個副孔。分別在TMZ干預24h、48h、72h后棄掉培養基，每孔加100μl配制好的CCK－8（DMEM／F12∶CCK－8＝9∶1），37℃溫箱孵育90min，上機檢測，檢測波長450nm，參照波長630nm。

1.4 細胞周期檢測

按照上述實驗設計分組，U251干細胞球胰酶消化、血清中和后制成單細胞懸浮液，收集細胞，1000r／min，離心5min，棄掉上清。加入預冷1×PBS漂洗1遍。加70%酒精輕輕吹打均勻固定4℃過夜，次日離心棄掉酒精，PBS漂洗1遍，棄掉上清，每步可殘留約50μl液體以免吸走細胞，加500μl配制好的PI染色液C染色緩沖液：PI（20×）∶RNaseA（50×）＝50∶2.5∶1，37℃溫箱孵育30min，4℃冰盒待檢。流式細胞儀采用激發波長488nm檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況，采用流式細胞儀自帶分析軟件分析數據。

2 結果

2.1 TMZ對U251細胞及其干細胞活性影響及TMZ細胞毒性

用400μmol／L的TMZ干預U251細胞及其干細胞48h后，發現貼壁的U251細胞增殖速度明顯低于空白對照組，細胞密度明顯小于對照組，培養基可見較多細胞碎片。U251干細胞在TMZ干預48h后，光鏡下可見細胞活性狀態明顯差于對照組，干細胞球完整性形態改變，有細胞裂解現象（圖1）。研究顯示隨著TMZ濃度增加和干預時間的延長，U251細胞和U251干細胞增殖受到抑制越明顯，單位體積內細胞密度越低，裂解越多。

CCK－8試劑盒連續檢測U251及其干細胞72h細胞增殖發現U251細胞增殖速度明顯快于U251干細胞，TMZ干預后能抑制U251及其干細胞增殖速度，并且隨著TMZ濃度增加抑制效果增強，同一濃度時，隨著干預時間的延長，抑制增殖效果也加強。同一藥物濃度和干預時間，CCK－8檢測研究發現TMZ對U251干細胞抑制趨勢弱于U251細胞，說明腫瘤干細胞比腫瘤細胞有更強的藥物抵抗性（圖2）。

圖1 TMZ抑制U251細胞及其干細胞增殖

圖2 TMZ對U251及其干細胞活性的影響

2.2 400μmol／LTMZ干預后24h、48h、72h細胞周期變化

研究結果發現，TMZ干預U251后，隨著TMZ濃度和干預時間的延長，細胞周期在G2／M期的比例增加。而TMZ干預U251干細胞后，隨著TMZ濃度和干預的時間的延長，細胞周期則是在S期停滯所占的比例增加。說明TMZ對腫瘤U251細胞和U251干細胞作用機制可能有所不同，導致細胞周期的改變存在差異。這也許是腫瘤干細胞成為化療耐藥和失敗的根本原因。在400μmol／L的TMZ干預24h、48h、72h后，U251在G2／M期比例分別增加（1.4±0.2）%、（18.61±1.1）%、（24.27±1.1）%。U251干細胞在S期比例分別增加（2.66±0.13）%、（14.3±0.5）%、（30.76±1.2）%（圖3）。

圖3 TMZ干預后細胞周期變化

3 討論

多形性膠質母細胞瘤是最常見、最致命的腫瘤，其中期生存時間1a左右。目前，GBM的治療的難關是原位復發、侵襲性生物學行為和彌散浸潤性生長。盡管隨著手術技術更新、放療和多種抗癌藥物的聯合應用，但惡性膠質瘤的治愈希望仍渺茫［6］。腫瘤干細胞假說認為腫瘤細胞中有干細胞樣特性的一個亞族細胞被稱為腫瘤干細胞，腫瘤干細胞被視為化療耐藥的介質，導致腫瘤形成［7］。CD133為一種新型的120KD五跨膜細胞表面蛋白，已被證明是造血干細胞的標記，近期實驗數據也證實CD133是大腦腫瘤的干細胞標記物［8］。我們利用免疫磁珠法成功從U251細胞系中分離出CD133＋干細胞，并在無血清培養基中培養后成功形成細胞球，經Nestin、GFAP、β－tubulin等免疫細胞化學染色證實細胞球具有神經干細胞特性，并且實驗發現U251干細胞在相同條件下對化療藥物TMZ的抵抗性強于U251腫瘤細胞，間接證明在腫瘤化療耐藥中干細胞可能起著關鍵作用，對此我們從化療藥物對腫瘤干細胞細胞周期的影響入手，尋找腫瘤干細胞和腫瘤細胞對同一化療藥物療效存在差異的不同機制，進一步解釋腫瘤干細胞在腫瘤發生、發展過程中的作用。

TMZ目前已經成為惡性膠質細胞瘤標準治療手段的不可缺少的一部分。作為一種新型烷化劑，TMZ是194KD的小分子親脂性分子，能口服和高效通過血腦屏障。TMZ在腦和腦脊液的分布能達到血漿濃度的30%～40%，此外，相比傳統的化療藥物其具有較低的對造血祖細胞的細胞毒性，降低對機體的毒副作用。TMZ與手術切除和放療聯合應用能延長GBM患者生存時間，成為膠質瘤治療的一線化療藥物［9］。我們實驗研究中用不同濃度的TMZ干預U251及其干細胞，并于藥物干預24h、48h、72h收集處理細胞，用流式細胞儀檢測細胞周期變化，結果顯示TMZ干預膠質瘤U251細胞后，隨著TMZ干預時間的延長，細胞周期在G2／M期變化的越明顯，與之前Kanzawa T等［9］研究報道的一致，說明TMZ對細胞周期的影響與干預時間有關。而同時對TMZ干預膠質瘤U251干細胞的研究發現TMZ干預后干細胞的細胞周期均停滯在S期，而且隨著干預時間的延長，停留在S期細胞越多，與Cui B等［10］研究發現TMZ在抑制DNA合成時存在雙相性、在第2個S期長效抑制DNA合成的結果類似。說明TMZ對U251和U251干細胞的藥理學作用機制存在差異，腫瘤細胞和腫瘤干細胞生物學特性不同，證實U251干細胞和U251細胞之間對化療藥物產生的細胞毒效應不同。因此，研究化療藥物對腫瘤細胞及其干細胞增殖和細胞周期的不同影響，進一步闡釋腫瘤耐藥機制，可以為膠質瘤靶向化療耐藥的進一步研究提供新靶點。

目前常用化療藥物都是針對腫瘤細胞，不能有效清除腫瘤實體內所有細胞，而腫瘤干細胞被認為是腫瘤復發和化療耐藥的重要原因［11］，腫瘤干細胞理論為治療膠質瘤提出了新的思路，靶向腫瘤干細胞的治療已成為治愈膠質瘤，克服膠質瘤耐藥和復發的根本解決途徑，我們實驗用臨床一線藥物TMZ干預膠質瘤U251及U251干細胞，發現TMZ作用于膠質瘤細胞和膠質瘤干細胞不同細胞周期而發揮效應的不同機制，為進一步研究靶向干細胞藥物治療奠定實驗基礎。

［1］ Boumendjel A，McLeer－Florin A，Champelovier P，et al.A novel chalcone derivative which acts as a microtubule depolymerising agent and an inhibitor of P－gp and BCRP in in－vitro and in－vivo glioblastoma models［J］.BMC Cancer，2009，9：242－253.

［2］ Ryu CH，Yoon WS，Park KY，et al.Valproic acid downregulates the expression of MGMT and Sensitizes Temozolomideresistant Glioma cells［J］.J Biomed Biotechnol，2012，987495.

［3］ Eramo A，Ricci－Vitiani L，Zeuner A，et al.Chemotherapy re－sistance of glioblastoma stem cells［J］.Cell Death Differ，2006，13：1238－1241.

［4］ Beier D，Schulz JB，Beier CP.Chemoresistance of glioblastoma cancer stem cell－much more complex than expected［J］.Mol Cancer，2011，10：128－139.

［5］ Jin F，Zhao L，Zhao Hy，et al.Comparison between cells and cancer stem－like cells isolated from glioblastoma and astrocytoma on expression of anti－apoptotic and multidrug resistance－associated protein genes［J］.Neuroscience，2008，154（2）：541－550.

［6］ Qiu B，Zhang D，Tao J，et al.A simplified and modified procedure to culture brain glioma stem cells from clinical specimens［J］.Oncol Lett，2012，3（1）：50－54.

［7］ Tchorz JS，Tome M，Cloetta D，et al.Constitutive Notch2signaling in neural stem cells prometes tumorigenic features and astroglial lineage entry［J］.Cell Death Dis，2012，3：1－9.

［8］ Donovan LK，Potter NE，Warr T，et al.A prominin－1－rich pediatric glioblastoma：abiologic behavior is determined by oxygen tension－modulated CD133expression but not accompanied by underlying molecular profiles［J］.Transl Oncol，2012，5（3）：141－154.

［9］ Kanzawa T，Germano IM，Komata T，et al.Role of autophagy in temozolomide－induced cytotoxicity for malignant glioma cells［J］.Cell Death Differ，2004，11（4）：448－457.

［10］ Cui B，Johnson SP，Bullock N，et al.Decoupling of DNA damage response signaling from DNA damage underlies temozolomide resistance in glioblastoma cells［J］.J Biomed Res，2010，24（6）：424－435.

［11］ Lima FR，Kahn SA，Soletti RC，et al.Glioblastoma：Therapeutic challenges，what lies ahead［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1826（2）：338－349.