頸椎黃韌帶疊壓癥兔黃韌帶TGF－β1的表達＊

吳 彬 孟純陽 王海濱 賈存嶺 趙益峰 賈代良

（濟寧醫學院附屬醫院，山東 濟寧272029）

頸椎病患者病因與頸椎間盤退變、關節突增生及黃韌帶肥厚密切相關［1－2］，其中黃韌帶肥厚在頸椎病的發病中起了重要的作用［3－4］。在此過程中，黃韌帶發生了何種組織學改變及細胞因子的變化，文獻鮮見報道。本文通過手術破壞新西蘭大白兔頸5／6椎間穩定結構，引起后方黃韌帶退變增生，在頸椎后伸時增生的黃韌帶突入椎管，造成對脊髓的壓迫，建立兔頸椎黃韌帶疊壓模型，觀察黃韌帶形態學、生物化學方面的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康3月齡新西蘭大白兔48只，雌雄不限，普通級，質量（3000±250）g，合格證號：SCXK（魯）20110013，由山東農業科學院畜牧獸醫研究所提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白酶購自美國Sigma公司，免疫組化TGF－β1試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 頸椎疊壓癥動物建模 48只新西蘭大白兔隨機分為2組，每組24只動物，模型組通過頸椎前路穿刺破壞纖維環及抽吸頸5／6髓核組織的辦法建立黃韌帶疊壓動物模型。10%水合氯醛（300mg／kg）腹腔注射麻醉，動物取仰臥位，以頸5為中心取前路縱切口長約3cm，逐層切開，鈍性分離，顯露頸5／6椎間盤，針刺法破壞纖維環并抽吸髓核組織，徹底止血后縫合深筋膜及皮膚，術中注意觀察呼吸、心率的變化，術后分籠喂養，肌注青霉素1周，4×105u／d，對照組動物不作處理。術后讓動物自由活動頸部。

1.2.2 頸5／6黃韌帶標本處理 建模后4、8、12周分別空氣栓塞法處死對照組、模型組各8只動物，鋒利刀片切取頸5／6黃韌帶組織，置于4%多聚甲醛中固定24h，10%EDTA中脫鈣72h，流水沖洗24h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋備用。石蠟包埋后進行連續切片備用，片厚5μm，進行蘇木精－伊紅染色，用日本奧林帕斯BX51顯微鏡進行觀察，免疫組化法檢測TGF－β1，一抗為TGF－β1抗體（武漢博士德生物工程有限公司），二抗為DAB顯色劑ZLI－9032（北京中杉金橋生物技術有限公司），使用高溫高壓抗原修復，37℃溫箱孵育2h，用DAB顯色，陽性顆粒呈棕黃色。

1.3 統計學方法

所有數據均用±s表示，采用SPSS13.0統計分析軟件進行統計學處理。

2 結果

2.1 頸5／6黃韌帶組織學變化

頸5／6黃韌帶組織進行蘇木精－伊紅染色，對照組頸5／6黃韌帶纖維環排列規則，細胞排列與分層的纖維環方向一致，纖維環的細胞呈梭形，其細胞核呈長茄形。模型組整個纖維環變得粗糙，排列紊亂，玻璃樣變性及色素沉著，纖維環中可見圓形的纖維軟骨細胞，纖維環之間形成裂隙，術后12周時最為明顯，見圖1。

2.2 頸5／6黃韌帶TGF－β1表達的變化

用SABC免疫組織化學方法標記黃韌帶中的TGF－β1，陽性顆粒呈棕褐色，定位于基質中，呈網束狀。

模型制作后4、8、12周，模型組黃韌帶TGF－β1的陽性染色面積較對照組明顯增加，兩組比較具有顯著性學意義（P＜0.01）；術后8周及12周組黃韌帶TGF－β1的陽性面積較術后4周組減少，兩兩比較無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表1。

圖1 兩組頸5／6黃韌帶組織學變化

圖2 兩組頸5／6黃韌帶TGF－β1的表達變化

表1 頸椎黃韌帶疊壓癥C5／6黃韌帶TGF－β1陽性表達面積（±s）

表1 頸椎黃韌帶疊壓癥C5／6黃韌帶TGF－β1陽性表達面積（±s）

分組 4周 8周 12周 F值P對照組模型組9.12±1.46 14.78±2.04 8.79±1.14 12.91±2.24 8.90±1.34 12.65±1.882.55＞0.05 6.37 4.63 4.62 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 t

3 討論

黃韌帶連接椎弓板，從上位椎弓板的下緣和內面，連至下位椎弓板的上緣和外面，參與圍成椎管的后壁和后外側壁。黃韌帶退變后拉伸增厚，頸椎后伸時黃韌帶形成皺褶，突入椎管，壓迫脊髓，嚴重者可致癱瘓，毛賓堯稱之為黃韌帶疊壓癥［5］。臨床上對其研究甚少，且文獻鮮見報道。本文模擬人頸椎退變的過程，前路破壞椎間盤的穩定性、降低椎間高度，造成后方黃韌帶拉伸、退變，增生、肥厚，頸椎后伸時突入椎管內壓迫脊髓。在此過程中我們發現TGF－β1在模型制作的早期明顯增加，而隨著時間的延長，未再持續增加，而是稍有下降，可能為頸椎黃韌帶退變的早期刺激TGF－β1的異常表達，而退變過程中，TGF－β1可能作為加速退變的因素仍持續表達。

頸椎的穩定平衡主要由2部分來維持，一是靜力性平衡，包括椎體、椎弓及其突起、椎間盤和相連的韌帶結構。二是動力性平衡，主要為頸部肌肉的調節與控制［6］。上述任何一個環節遭受破壞，均可能引起或誘發頸椎正常結構及平衡功能的喪失，從而導致頸椎不穩定，加速椎間盤及后方黃韌帶的退變。本文通過頸椎前側入路，針刺破壞了纖維環，并抽吸出髓核組織，使頸椎前方穩定性下降，同時椎間高度下降，導致頸椎后方穩定性受到影響，表現為黃韌帶退變、增生、肥厚，后期黃韌帶突向椎管，壓迫脊髓，同時黃韌帶本身的形態學發生改變。對照組正常黃韌帶纖維排列規則，細胞排列與分層的纖維方向一致，纖維的細胞呈梭形，其細胞核呈長茄形。而模型組整個纖維變得粗糙，排列紊亂，玻璃樣變性及色素沉著，纖維之間形成裂隙，術后12周時最為明顯，并出現了纖維骨化的表現。

TGF－β1是一種調節細胞生長與分化的超家族分子，幾乎參與了哺乳動物所有細胞的病理生理過程，尤其在細胞外基質的產生及調控方面意義重大［7－8］。正常情況下TGF－β1在頸椎黃韌帶中少量表達，當黃韌帶受到刺激后表達增加，本文證實了這一點。在我們制作的模型中，椎間高度降低，頸椎穩定受到影響，后方的黃韌帶生物力學改變，受刺激后發生退變，出現增生、鈣化、骨化。TGF－β1在黃韌帶受到刺激的早期即出現大量表達，隨著時間的變化，不是持續的增長，而是在保持高水平的過程中略有下降。TGF－β1表達增加可能為黃韌帶退變的首要原因及促成因素。

脊柱穩定結構對維持脊柱的正常形態和生理功能意義重大［9－11］。本實驗破壞了頸椎前方靜力平衡結構，這種平衡的失調導致后方黃韌帶的受力改變，從而導致了黃韌帶退變、增生、突向椎管，形態學表現為黃韌帶纖維層次結構不清，玻璃樣變性，后期出現纖維骨化，在生物化學方面表現為黃韌帶中TGF－β1表達增加。

綜上，前方椎間高度的降低及穩定性改變會導致后方黃韌帶退變、拉伸、突向椎管，形成黃韌帶疊壓，引起TGF－β1的表達增加，這可能是引起黃韌帶退變的主要因素之一，但由于黃韌帶退變的機制較為復雜，我們研究的時間較短，是否還有其他細胞因子的參與，需要進一步的研究。

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