2項對診斷兒童人巨細胞病毒活動性感染的比較

李 麗（廣東省化州市人民醫院檢驗科 525100）

人類巨細胞病毒（HCMV）感染在我國相當普遍，是最常見的宮內感染病原體，可經血液、唾液、精液、乳汁等分泌物傳播[1]。HCMV對人類影響很大，尤其對免疫功能低下者，如孕婦、嬰幼兒、器官移植、惡性腫瘤類患者還有放射損傷、獲得性免疫缺陷綜合征等。故對小兒CMV感染作早期診斷檢測是十分必要的。HCMV感染可導致先天性畸形，智力低下，發育遲緩等，嚴重可引起肝炎、肺炎等胃腸道疾病[2]。本文對91例臨床疑似CMV感染的患兒進行檢測，并對其檢測方法進行了比較，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年4月至2011年6月在本院住院治療臨床上懷疑為CMV感染的患兒共計91例，男47例，女44例。年齡1個月至10歲，其中1歲以內38例，占41.8%，大于1歲53例，占58.2%。

1.2 CMV pp65抗原血癥檢測 采用CMV BriteTMTurbo試劑盒檢測，由北愛爾蘭IQ公司提供。嚴格按照試劑盒說明操作。肝素或乙二胺四乙酸抗凝的空腹全血3～5mL，2h內送檢。取蒸餾水1∶10稀釋A液（紅細胞裂解液），把2mL血與30mL稀釋A液混合，置4℃5min，2 500r/min離心2min，棄上清液。若裂解紅細胞不理想，再重復一次。把細胞團懸于30mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，2 500r/min離心2min，棄上清液。PBS調整細胞濃度為2×106/mL。每份標本制備3張片，2張做檢測，1張做背景對照。用PBS 1∶5稀釋B液（固定液），用PBS 1∶5稀釋C液（滲透液），將2張片插入B液5min，再將所有片子放入PBS洗液3min，然后放入C液1 min，洗片。加35μL單抗（D液），37℃20min，洗片，晾干，細胞片不能干透。加入35μL FITC標記抗體（E液），37℃20 min，洗2次后用自來水輕輕洗片，蓋片。

用熒光顯微鏡觀察結果，鏡下觀察全部細胞，pp65陽性細胞為均勻圓形/多葉核染色，綠色或黃綠色。陽性細胞大于5個/5×104為陽性。

1.3 CMV DNA檢測 取同期患兒尿液，采用深圳匹基公司HCMV DNA熒光定量檢測試劑盒，擴增循環條件按試劑盒的設定進行，聚合酶鏈反應（PCR）擴增循環次數為42個。檢測系統由伯樂公司提供，同時連接計算機，對整個PCR過程中PCR產物熒光值進行實時檢測，操作嚴格按說明書進行。

1.4 血清CMV IgM檢測 取同期患者血清，采用微粒子酶免疫分析，嚴格按照試劑說明操作，試劑由美國Abbott公司提供。

1.5 統計學方法 采用一般χ2檢驗比較pp65與CMV DNA、CMV IgM之間的關聯性，P＜0.05為有關聯性；用配對設計的χ2檢驗（χm2）比較不同檢驗方法結果的差異性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3項共檢測患兒91例，結果見表1。由表1可見，CMV DNA 陽性率最高，為49.5%，其次為CMV pp65，為37.4%。

表1 3項檢測CMV感染結果

2.2 91例CMV患兒血pp65與尿CMV DNA和血CMV IgM檢測結果 見表2。由表2可見，pp65抗原血癥與尿CMV DNA兩種方法陽性分別為34例和24例，均具有較高的檢出率，兩種方法所檢測的結果有明顯相關性（χ2＝9.70），且結果之間差異無統計學意義（χm2＝3.23，P＞0.05）。pp65與血CMV IgM檢測結果之間無明顯相關性（χ2＝0.77），兩種方法結果差異有統計學意義（χm2＝12.03，P＜0.01）。pp65抗原血癥與尿CMV DNA陽性符合率為75.6%（34/45），陰性符合率為80.7%，與IgM 陽性符合率為29.4%（10/34），陰性符合率為70.4%（57/81）。pp65相對于PCR的敏感性為75.6%（34/45），特異性為 70.6% （24/34），與 HCMV DNA 相比，pp65抗原的符合率為85.5%，與IgM抗體檢測的符合率為70.3%。

表2 91例CMV患兒血pp65與尿CMV DNA和血CMV IgM檢測結果

3 討 論

CMV感染在我國相當普遍，大多在幼年時期發生。多數感染者無明顯癥狀，但在嬰兒期和有免疫抑制的個體可引起嚴重疾病[3]。CMV感染狀態可分為潛伏感染和激活感染，由于健康人群中CMV潛伏感染也較常見，因此區分潛伏感染和激活感染是臨床診斷CMV感染的關鍵。目前臨床上常用檢測CMV的項目有血CMVpp65、尿CMV DNA及血CMV IgM[4]。

本文結果顯示，血CMVpp65和尿CMV DNA 2項檢測結果均有較高的陽性率，陽性符合率也較高，且統計學顯示結果上具有明顯相關性，結果之間差異無統計學意義。CMV pp65是CMV－u183基因編碼的即刻早期蛋白，在CMV DNA復制前就有合成，調控隨后的病毒基因的表達及DNA合成，是體內活動性CMV復制的標志。因此，CMV激活感染時，pp65持續高水平表達，潛伏感染時表達極低，一般檢測不到。而且pp65抗原血癥可在激活感染早期即呈陽性。目前認為pp65抗原是HCMV感染時外周血白細胞中最容易被檢出的CMV抗原，HCMV pp65抗原血癥作為免疫組化法直接檢測血液白細胞中的CMV抗原，不但具有快速、簡便、容易操作的特點[5－7]，而且還能根據結果區 分患者 CMV 的感染狀態，在CMV活動性感染及預后判斷上有明顯優勢。有研究表明，可以根據CMV抗原血癥水平來推斷CMV感染的類型和時期，原發感染抗原血癥水平高，繼發感染抗原血癥水平低；感染初期及恢復期水平低，發生進展性CMV疾病時水平迅速上升。PCR檢測技術是近年來新興的一種技術，具有簡便、快速、敏感且檢測標本要求低等特點，但是PCR要求有較嚴格的實驗場所，否則極易出現假陰性或假陽性結果；并且PCR要求有一定的設備，如PCR擴增儀，還要求有合理的引物設計及需要購Tap酶等，花費較大。由于PCR的高靈敏性，存在敏感性雖高但特異性差的缺點，而且PCR檢測陽性不能區分是潛伏感染還是激活感染，所以PCR的應用受到一定的限制。

本組實驗CMV IgM的檢出率較低。IgM的量不僅與病毒負荷有關，還與患者免疫功能狀態有關。CMV感染患兒多有免疫功能低下，也影響其敏感性和特異性。另外檢測血CMV IgM易受類風濕因子及特異性IgG的影響，靈敏度較低。因此，檢測CMV IgM在診斷CMV感染中的價值受到限制。

對于CMV感染，pp65抗原血癥法檢測CMV pp65抗原是一種敏感、特異、快速的診斷方法；不僅能早期診斷，其量化結果有助于評價感染狀態與判斷預后，也是觀察治療后果的有效檢測手段[8]。pp65抗原血癥法方法學幾經完善，已成為國際公認的活動性HCMV感染診斷的“標準”方法，以后相繼建立的方法均以此方法作為對照。

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