新型冷熱交替熱物理治療腫瘤的生物學效應研究

任曉敏，劉蘋,

1 上海交通大學生物醫學工程學院，上海市，200240

2 上海交通大學Med-X研究院，上海市，200030

0 引言

腫瘤是發病率、致死率最高的常見病、多發病之一[2]。目前腫瘤治療如手術、放療和化療，效果還不理想，且副作用很大[3-5]。特別對于已發生轉移的腫瘤，幾乎沒有有效的治療方法。由于惡性腫瘤血管異常增生，與正常血管相比，管壁薄弱、分化程度低，缺乏平滑肌及完整的基底膜結構，內皮細胞之間存在較大縫隙，通透性強，更有利于腫瘤細胞穿透血管壁形成遠端轉移灶[6-7]。針對目前腫瘤治療現狀，迫切需要尋求新型的腫瘤治療方法。

大多數惡性腫瘤都會引起不同程度的免疫抑制，以利于腫瘤逃避機體免疫監視和攻擊, 促進腫瘤發展[8-9]。髓源性免疫抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）高表達髓系分化抗原GR1和CD11b（GR1+CD11b+細胞），在荷瘤鼠和腫瘤病人中大量增加，引起機體的免疫抑制。MDSCs參與腫瘤免疫逃逸的方式可概括為兩個方面，一方面MDSCs可以表達多種促血管形成因子直接促進腫瘤血管的形成。MDSCs細胞的浸潤介導了腫瘤對抗血管生成治療產生不應性，使得抗血管生成療法的失效[10]。另一方面MDSCs可以通過表達高水平的ARG1、iNOS和ROS來抑制T細胞介導的特異性抗腫瘤免疫，誘導調節性T細胞(regulatory T cells, Tregs)產生及抑制NK和巨噬細胞介導的天然抗腫瘤免疫[11]。MDSCs已被認為是引起腫瘤動物試驗及臨床病人免疫治療失敗的主要因素。中華醫學提示我們，“藥要向內求”。疾病治愈的根本應該在于機體系統對于外界干預的應答能力。所以腫瘤治療的新思路應該是局部治療的同時，是否最大程度的解除機體免疫抑制狀態。

熱物理治療是通過外界能量介入體內破壞腫瘤的治療方法。與傳統治療方法相比較，它通過短時間內實現極高溫或極低溫達到破壞腫瘤組織，具有微創性和副作用小等優勢。且研究表明，熱療時可調控包括抗原提呈細胞（APCs）、T細胞和自然殺傷細胞（NK）的活性[12-13]。熱刺激還可以導致壞死的腫瘤細胞釋放一些損傷相關的分子模式分子（damageassociated molecular pattern molecule，DAMP），誘導機體抗腫瘤免疫反應。然而，單獨冷療和熱療仍然存在一些局限性[14-15]，大大限制了兩者在臨床上的應用。我們設計并研制了一套新型的液氮射頻冷熱交替熱物理治療系統[1]。在前期研究中，基于小鼠4T1乳腺癌裸鼠脊背視窗模型，發現冷熱交替治療相對于熱療或冷療對腫瘤新生血管具有更強的破壞能力[16]。另外建立了皮下高轉移性4T1小鼠乳腺癌模型，該腫瘤模型在生長21 d即在脾臟、肺部形成微轉移灶[17]。經過冷熱交替治療后，存活率明顯提高，且治療后無復發，小鼠血清內Th1型細胞因子的含量明顯上升[18]，提示可能激起了機體的抗腫瘤免疫響應。此免疫響應不但使原位腫瘤消融，而且抑制了已經存在的微轉移[19]。但目前對其治療機制還不清楚。

基于前期的研究，提出如下假說：通過應用非極限溫度進行冷熱交替局部刺激腫瘤組織，在短時間內物理性地破壞大量腫瘤細胞和腫瘤微循環，釋放腫瘤特異性抗原而激活免疫相關因子，然后促進遞呈細胞的活化和抗原傳遞，及外周淋巴結遷移，解除免疫細胞MDSCs對機體抗腫瘤免疫的抑制，從而協同激活機體的特異性抗腫瘤免疫響應，達到由腫瘤局部治療到全身系統性的治療的效果。本文以4T1乳腺癌為模型，研究腫瘤局部治療后，原位腫瘤的損傷及對外周血和脾臟中免疫抑制細胞MDSCs的影響。Micro-CT成像觀察腫瘤血管的損傷，蘇木素伊紅染色研究腫瘤組織壞死；流式細胞術分析外周血中MDSCs的改變以及免疫熒光研究脾臟中MDSCs浸潤的變化；同時進行治療后三個月的療效觀察，分析冷熱交替治療可能存在的機制。

1 材料和方法

1.1 動物、細胞系及主要試劑

6～8周齡SPF級Balb/c雌性小鼠（上海斯萊克動物中心），飼養在獨立換氣盒籠中，人工控制12小時晝夜變換光照。小鼠自由攝取60Co輻射滅菌的飼料及高溫滅菌水。小鼠4T1乳腺癌細胞（上海市第一人民醫院饋贈），培養在加有10%的新生胎牛血清（杭州四季清有限公司）及雙抗（100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素）（上海生工生物工程技術服務有限公司）的RPMI1640培養基中（美國Hyclone公司）。超細沉淀硫酸鋇顆粒購于上海澤文貿易有限公司。用于流式細胞術和免疫熒光的抗體FITC標記的CD11b和PE標記的Gr-1購于Biolegend公司。蘇木素和伊紅溶液購自上海虹橋樂翔醫用試劑有限公司。

1.2 4T1乳腺癌模型的建立及腫瘤大小的測定

制備1×106U/ 0.1 mL 4T1細胞懸液置于冰上待用。按0.5 mL/100 g小鼠體重腹腔注射0.016 g/mL戊巴比妥鈉對動物進行麻醉，在小鼠背部皮下注射0.1 mL細胞懸液。腫瘤接種21 d后，游標卡尺測量腫瘤體積，按如下公式計算：V (cm3) =π×腫瘤長軸(cm) ×腫瘤短軸(cm) × 腫瘤高度(cm) / 6。隨機將荷瘤小鼠分為荷瘤對照組，溫熱組和冷熱交替治療組。

1.3 冷熱交替治療

1.3.1 實驗方案

在實驗中共包括三組：荷瘤對照組、溫熱組和冷熱交替治療組。實驗內容如下：(1) 腫瘤血管損傷：治療1 h后，每組3只小鼠，比較不同組腫瘤血管的損傷；(2) 腫瘤組織病理分析：治療1 h后，每組3只小鼠，分析原位腫瘤組織損傷；(3) MDSCs的變化：治療24 d后，每組3只小鼠，流式細胞術分析外周血中MDSCs以及脾臟組織切片分析脾臟組織中MDSCs的變化；(4) 存活率：每組8只小鼠，治療后3個月觀察各組小鼠的生活狀態，分析小鼠存活時間。

1.3.2 冷熱交替治療系統

采用實驗室自主研發的冷熱交替治療系統[1]。該系統包括液氮制冷和射頻加熱兩個模塊，如圖1所示。在治療過程中，為了減小接觸阻抗并確保治療劑量的統一性，設計了專門適用于該系統的圓形探針，見圖2。并且此探針適合本實驗的體表腫瘤模型[20]。

1.3.3 實驗過程

圖1 冷熱交替治療系統示意圖[1]Fig.1 Sketch of the alternate thermal system[1]

腫瘤接種21 d時進行治療，治療前測量腫瘤體積，此時平均值為0.2 cm3。治療前，將荷瘤小鼠隨機分為三組：荷瘤對照組、溫熱組和冷熱交替組。首先對需要治療的小鼠麻醉，然后用酒精和碘酊對腫瘤部位消毒。

治療時，探針貼在腫瘤表面，將一根測溫用的熱電偶插入腫瘤基底部。溫熱治療采用射頻加熱，將腫瘤的溫度加熱至50oC(熱電偶所測的溫度)，并保持15 min。冷熱交替治療分為三個過程：(1)冷凍 用液氮致冷的方法將腫瘤溫度降至-20oC，保持5 min；(2)復溫 冷凍治療后，等待腫瘤自然復溫至10oC左右；(3) 加熱 復溫過程結束，射頻加熱將腫瘤溫度升至 50oC，保持10 min。治療完成后，將三組小鼠各分為4部分，用于不同的實驗研究。

圖2 冷熱交替治療探針[20]Fig.2 The treatment probe of alternate thermal system[20]

1.4 腫瘤新生血管觀察

利用微血管造影技術，以硫酸鋇為造影劑，Micro-CT成像，評價不同治療方式引起腫瘤血管的損傷程度。取超細沉淀硫酸鋇顆粒溶于0.3 g/ml的生理鹽水中，充分溶解后，用超聲波粉碎機超聲20 min以上得到合適的硫酸鋇造影劑待用。治療1 h后，小鼠麻醉，用硫酸鋇造影劑對小鼠進行心臟灌注。灌注結束，將腫瘤取下，福爾馬林固定、干燥，Micro-CT(Xredia, MicroXCT-200, Inc., USA)成像。成像參數如下：管電壓，30 kVp；管電流，200 μA；分辨率，2.5 μm～3 μm；曝光時間，15 s；球管距離，35 mm；探測距離：24 mm；層厚，1.83 μm；層距，0；像素，0.001 83 mm；體素，1.83 μm × 1.83 μm×1.83 μm；掃描視野，1.78 mm ×1.78 mm。投影張數1 500張。重建得到三維結果。

1.5 蘇木素伊紅染色（HE）

將冷凍保存的各組腫瘤組織從-80oC冰箱取出，冰凍切片包埋劑（OCT）固定，沿著組織的矢狀線方向切片（LEICA CM1900），切片厚度為10 μm，冰凍切片重新保存在-80oC冰箱待用。HE染色時，首先將冰凍切片從-80oC冰箱取出，在自來水中浸泡5 min。然后在蘇木素溶液中浸染5 min，自來水反藍30 min后，伊紅浸染5 min。使用梯度酒精使組織脫水，二甲苯浸泡使之透明。最后使用中性樹膠封片，并正置在顯微鏡下觀察拍片。

1.6 免疫熒光

治療24 d后，將各組小鼠的脾臟取下，經冷凍的異戊烷浸泡后，保存在-80oC冰箱待用。切片過程同1.5，脾臟冰凍切片重新保存在-80oC冰箱待用。免疫熒光染色時，將脾臟組織切片從-80oC冰箱取出，自然風干后，在4oC丙酮中固定，經過0.1% Triton X-100透膜以及5%牛血清白蛋白BSA封閉非特異性抗原，加入PBS（Phosphate Buffered Saline）稀釋的熒光一抗，置于4oC孵育過夜。避光吹干組織，加入含DAPI的防淬滅劑封片（VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI，Vector Laboratories）。封片后的組織避光保存，激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5)觀察并拍照。

1.7 流式細胞分析

治療后24 d，眼球采血0.5 ml，加入0.9%氯化銨裂解液以裂解外周血中的紅細胞，離心收集小鼠外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。PBS重懸、清洗后，加入熒光抗體在4oC避光孵育30 min，再次PBS清洗。移入流式管，在流式細胞儀（BDFACS AriaTMII）上檢測并分析。

1.8 存活時間分析

治療后3個月觀察小鼠生活狀態，分析各組小鼠的存活時間。

2 結果

2.1 原位腫瘤血管的損傷

血管造影顯示對照組荷瘤小鼠中腫瘤血管豐富。腫瘤的邊緣存在一些大的血管分支，中心區域則有眾多的腫瘤新生血管叢，見圖3(a)。經過溫熱治療之后，腫瘤中心和腫瘤邊緣的血管都顯著減少，見圖3(b)，腫瘤血管只存在于腫瘤基底部位和邊緣區域，并且血管形態發生了明顯的改變，膨脹程度增加。圖3(c)顯示冷熱治療后血管破壞嚴重，幾乎不存在。表明熱物理治療能夠對腫瘤血管起到較嚴重的破壞作用，切斷對腫瘤氧氣和營養物質的供給，而腫瘤冷熱交替治療比溫熱治療效果更加顯著。

2.2 原位腫瘤組織的損傷

HE染色結果發現無論在腫瘤的中心區域和邊緣區域，相對于荷瘤對照組和溫熱組，冷熱交替治療造成了嚴重的組織壞死，其中尤與邊緣區域更為明顯，見圖4，細胞核（藍色）減少，壞死后出現的紅色間質增多。

圖3 腫瘤新生血管損傷結果Fig.3 Tumor microvasculature lesion results

圖4 蘇木素伊紅染色腫瘤組織損傷Fig.4 Hematoxylin and eosin staining showed necrosis in tumor

2.4 外周血中免疫抑制細胞的變化

外周血是MDSCs分布的重要場所。治療24 d后（即接種45 d），荷瘤對照組小鼠出現大量死亡，為保證有完整的對照組，觀察最終冷熱交替對脾臟浸潤免疫抑制細胞的作用，因此選取治療24 d分析外周血中MDSCs細胞的改變。圖5是小鼠流式檢測結果，MDSCs為CD11b+Gr-1+細胞，利用流式細胞術可以定量分析出其所占PBMC的比例。治療后24 d，以正常組小鼠含量為基準，對照組小鼠外周血中MDSCs所占百分顯著增加，達到28.7%。溫熱組與對照組相比有所下降，為19.6%，但也沒有達到正常小鼠的水平。冷熱交替治療后MDSCs恢復至正常水平。

2.5 脾臟中免疫抑制細胞解除

圖5 外周血中各組MDSCs的變化Fig.5 Flow cytometry detects MDSCs changing in PBMC of different groups

脾臟是小鼠重要的免疫器官，荷瘤小鼠脾臟中會浸潤大量的免疫抑制細胞。治療24 d后，利用免疫熒光檢測脾臟中MDSCs細胞的改變。激光共聚焦的免疫熒光結果，見圖6，發現冷熱交替治療后脾臟中MDSCs數量顯著下降。與對照組相比，溫熱治療后脾臟中的MDSCs也明顯減少，但依然存在一定數量的免疫抑制細胞，機體的免疫抑制并沒有被完全解除。

圖6 激光共聚焦顯微鏡的免疫抑制細胞熒光圖Fig.6 Confocal microscopy immuno fluorescence images of immune suppressive cells after the thermal treatments

2.6 腫瘤冷熱交替可以顯著提高存活率

對治療后的小鼠治療進行3個月的觀察，每組8只小鼠。冷熱交替治療后，其中7只小鼠生活狀態良好，沒有發生任何體表轉移。對照組小鼠在接種后50 d內全部死亡。溫熱治療雖然能夠延長小鼠的存活時間，但大部分小鼠在60 d內死亡，只有1只在3個月內沒有發生體表轉移的現象。因此，冷熱交替治療腫瘤可以極大的提高小鼠生存率，達到良好的治療效果。

3 總結和討論

本研究以4T1乳腺癌為模型，研究冷熱交替局部腫瘤治療后，原位腫瘤的損傷及對外周血和脾臟中免疫抑制細胞MDSCs變化及對療效的影響，分析冷熱交替治療腫瘤的可能的機制。研究結果表明，冷熱交替治療可以造成更嚴重的腫瘤血管破壞以及組織壞死。更重要的是解除了外周血和脾臟中的抗腫瘤免疫抑制，最終達到很好的治療效果。

冷熱交替治療所達到的較高的治療效果，主要歸因于以下三個方面。首先，冷熱交替治療破壞大量的腫瘤血管。腫瘤血管在腫瘤的生長、轉移和復發過程中起到了重要的作用[21]，是許多腫瘤治療中的靶點。相對于熱療，冷熱交替治療對腫瘤血管產生更嚴重的破壞，降低了腫瘤細胞通過血管轉移到遠端的風險。其次，冷熱交替治療造成更嚴重的組織壞死，腫瘤細胞壞死可以釋放出具有促炎癥功能的DAMP[22-24]以及抗原肽，通過促進腫瘤抗原的呈遞、激活DC細胞的活性并促進其成熟的方式誘導抗腫瘤免疫[25]。同時，壞死組織釋放的抗原肽作為危險信號使得殘留的腫瘤細胞對CTL的殺傷作用更敏感[26]。 再次，冷熱交替治療可以解除外周血和脾臟中MDSCs的聚集。MDSCs（CD11b+Gr1+）的增加是腫瘤生長和轉移的標志性特征[27]，可以抑制腫瘤特異性CD8+T細胞的功能，導致許多癌癥的不良預后[28]。近年來，免疫抑制細胞已經成為腫瘤治療中新的靶點[29]。外周血和脾臟中MDSCs的降低預示著局部治療會解除機體全身的免疫抑制。

相比之下，盡管熱療也可以產生腫瘤細胞的壞死，誘導抗腫瘤免疫[30-32]。但是治療過后，外周血和脾臟中MDSCs 的含量不能恢復至正常水平，即免疫抑制沒有完全解除。說明熱療激起的抗腫瘤免疫響應不足以將殘留的腫瘤細胞全部殺死，導致治療過后腫瘤的復發和轉移。另一個方面，熱療過后，腫瘤血管沒有被完全破壞，增加了殘留腫瘤細胞通過血管轉移到遠端的可能。

本研究以自主研發的冷熱交替治療儀為基礎，創新性的提出了冷熱交替治療腫瘤的治療方案。同常規的熱療相比較，冷熱交替治療可獲得較高的存活率。表明冷熱治療對于轉移性腫瘤具有很好的治療效果，該效果可能是由腫瘤的局部損傷引起了機體全身的抗腫瘤免疫響應引起，是一種由局部到全身的治療方式，更多的機制將進一步深入研究。冷熱交替有可能成為將來治療轉移性腫瘤的新型熱物理治療方法。

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