低氧對大鼠大腦皮層細胞表達血管內(nèi)皮生長因子的影響

周躍輝， 袁海平， 婁淑杰

（上海體育學(xué)院運動科學(xué)學(xué)院，上海200438）

低氧對大鼠大腦皮層細胞表達血管內(nèi)皮生長因子的影響

周躍輝， 袁海平， 婁淑杰

（上海體育學(xué)院運動科學(xué)學(xué)院，上海200438）

觀察不同氧濃度環(huán)境下不同時間處理對大腦皮層細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及表達VEGFmRNA的影響。方法：原代培養(yǎng)SD大鼠大腦皮層細胞，5 d后將低氧組細胞轉(zhuǎn)移至低氧工作站，在1%和4%氧濃度環(huán)境下分別處理3 h和6 h，其相應(yīng)的常氧對照組細胞則繼續(xù)放置于CO2孵箱中。采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中VEGF蛋白含量，采用RT-PCR法檢測細胞內(nèi)VEGF mRNA表達水平。結(jié)果：與對照組相比，在4%和1%氧濃度環(huán)境下3 h組細胞VEGFmRNA及蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），但均有增加趨勢，而6 h組引起VEGFmRNA及蛋白表達明顯增高（P＜0.05），且1%氧濃度6 h組增幅更大（P＜0.01）。結(jié)論：低氧可誘導(dǎo)大鼠大腦皮層細胞分泌VEGF和表達VEGFmRNA，且皮層細胞的反應(yīng)性與低氧濃度、低氧刺激時間有關(guān)。

低氧；大鼠；皮層細胞；血管內(nèi)皮生長因子；ELISA；RT-PCR

Author's addressSchool of Kinesiology，Shanghai University of Sport，Shanghai200438，China

氧是機體進行新陳代謝等生命活動的必需因素，氧穩(wěn)態(tài)則是維持細胞正常生理功能的重要條件，環(huán)境中氧濃度的變化可影響細胞的功能狀態(tài)。低氧訓(xùn)練是一種提高運動員體能的訓(xùn)練方法，可使機體產(chǎn)生一系列有利于提高運動能力的抗缺氧生理反應(yīng)及適應(yīng)［1］。低氧訓(xùn)練對外周器官結(jié)構(gòu)和功能影響的研究更多地集中在呼吸［2］、循環(huán)［3］、血液［4］和骨骼肌［5］等方面，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究很少。有關(guān)低氧對腦結(jié)構(gòu)和功能的研究結(jié)果主要來源于缺血性低氧方面，且多為缺血后再灌注［6］，關(guān)于單純低氧處理后即刻對大腦皮層細胞功能變化的研究鮮有報道。本課題組已有研究結(jié)果顯示，低氧環(huán)境培養(yǎng)大腦皮層細胞的條件液能明顯促進神經(jīng)干細胞增殖和調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞分化。以往的在體研究也表明，缺血可明顯增加海馬齒狀回內(nèi)新生細胞的數(shù)量，運動則可進一步提高海馬的神經(jīng)發(fā)生水平［7］。至于缺血和運動在體引起神經(jīng)發(fā)生的機制，研究認為與中樞VEGF表達水平增加相關(guān)［8-9］，但還缺乏有關(guān)細胞和分子水平的離體研究。本文擬通過觀察單純低氧濃度處理后即刻對原代培養(yǎng)大腦皮層細胞表達VEGF的影響，探討大腦皮層細胞在不同低氧暴露程度和時間下表達VEGF的情況，旨在為低氧訓(xùn)練可影響神經(jīng)干細胞增殖和分化提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康新生24 h內(nèi)SD大鼠，雌雄不限，購于中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)動物研究中心［SCXK（滬）2008-0016］。

1.2 試劑與儀器 Neurobasal培養(yǎng)基和B27（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶、多聚賴氨酸粉、鼠源膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白GFAP、兔源Anti-β-Tublin III及異硫氰酸熒光素FITC羊抗兔IgG（Sigma公司），青鏈霉素溶液和Hoechst33258染色液（碧云天生物公司），D-Hank's液（sangon公司），大鼠VEGF ELISA試劑盒（美國Ray Biotech公司），Alexa Fluor488羊抗鼠IgG、Trozol Reagent、逆轉(zhuǎn)錄及SYBR Green I PCR試劑盒（invitrogen公司），VEGF和GAPDH引物序列由invitrogen公司合成，CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo美國），低氧工作站（Don Whitley Scientific英國），倒置顯微鏡（Leica德國），酶標儀（BioTeck美國），熒光定量PCR儀（Applied biosystems美國）。

1.3 大腦皮層細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 取新生24 h內(nèi)SD大鼠，在無菌條件下分離出雙側(cè)大腦皮層，剪碎、消化（0.125%胰蛋白酶15 m in）、過濾（200目網(wǎng)篩）、離心（轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，時間為8 m in）。棄上清，加入添加2%B27和1%青鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)基，吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為（6.5～7.5）×105m L-1接種于預(yù)先用0.01%多聚賴氨酸包被的48孔細胞培養(yǎng)板中（臺盼藍染色計數(shù)細胞存活率在92%以上），于37℃、5%CO2、95%空氣的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。免疫組織化學(xué)雙重染色法鑒定皮層細胞，其中神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的鑒定分別采用Tublin-III和GFAP免疫細胞化學(xué)染色，細胞核染色采用Hoechst33258染色液。

1.4 大腦皮層細胞低氧處理方案 分離的皮層細胞在CO2孵箱中培養(yǎng)5 d后，為所有細胞更換新的培養(yǎng)基，然后將低氧組細胞轉(zhuǎn)移至低氧工作站，在1%和4%氧濃度環(huán)境下分別處理3 h（H3）和6 h（H6），其相應(yīng)的常氧（20%）對照組細胞（C3和C6）則繼續(xù)放置CO2孵箱中。低氧處理結(jié)束后，收集常氧和低氧條件下的細胞培養(yǎng)液及細胞，-80℃凍存。本實驗設(shè)1%、4%和20%3個氧濃度，每個氧濃度設(shè)2個復(fù)孔，每個實驗重復(fù)3次。

1.5 采用ELISA法檢測細胞上清液VEGF蛋白含量采用雙抗體夾心BA-ELISA法，大鼠VEGF單抗包被于微孔酶標板內(nèi)，依次加入標準品、樣品、生物素化的抗大鼠VEGF、辣根過氧化物酶標記的Streptavidin，經(jīng)溫育形成抗原-抗體反應(yīng)體系與親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物并徹底洗滌，加入底物TMB顯藍色，最后加入終止液硫酸顯黃色。顏色深淺與樣品中蛋白濃度正相關(guān)。酶標儀450 nm處測定OD值，通過繪制標準曲線求出細胞上清液中VEGF的濃度。

1.6 采用RT-PCR法檢測細胞VEGFmRNA表達量1.6.1 細胞樣品總RNA的抽提 解凍細胞，加入適量Trizol裂解細胞，加入適量氯仿、異丙醇、75%乙醇和DEPC水分別純化、沉淀、洗滌和溶解總RNA，用紫外分光光度計測RNA D260/280比值，評價RNA純度。

1.6.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取5μg總RNA，按invitrogen公司cDNA合成試劑盒說明書，用梯度PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄，總體系為20μl。反應(yīng)條件為：25℃，5 min；50℃，60 min；70℃，15 min終止反應(yīng)。

1.6.3 RT-PCR擴增反應(yīng) 大鼠VEGF上游引物序列：5'-GGGTATAGCTCAGGAGGACCTTG-3'，下游引物序列5'-AGGGTAAGCCACTCACACACA-3'。擴增條件為95℃預(yù)變性2 m in后，按變性（95℃，10 s）→退火（60℃，30 s）→延伸（70℃，30 s）共40個循環(huán)，從70℃→95℃10 min范圍內(nèi)收集熒光信號，得到溶解曲線。選看家基因GAPDH作內(nèi)參。上游引物序列：5'-GACAAGATGGTGAAGGTCGGT-3'；下游引物序列：5'-CTTTGGCATCGTGGAAGGGCTC-3'。用2-ΔΔcT法對qPCR結(jié)果進行相對定量分析，2-ΔΔcT表示待測樣本與參照樣本之間目的基因的倍數(shù)變化。

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù) ±標準差表示，其中 Ct值由2-ΔΔcT處理，兩組之間結(jié)果的比較采取獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 大腦皮層細胞的培養(yǎng)和鑒定以及總RNA純度5 d后，在倒置顯微鏡下可見細胞胞體豐滿，呈梭形或不規(guī)則形，細胞突起增粗變長并連接成密集網(wǎng)絡(luò)，細胞開始聚集生長，表明細胞生長狀態(tài)較好，適宜做實驗研究（圖1a）。雙重染色法顯示，培養(yǎng)的皮層細胞主要為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞（圖1b）。從皮層細胞提取的總 RNA，用 D260/280進行純度分析，比值為1.8～2.1。

2.2 不同低氧環(huán)境對大腦皮層細胞分泌VEGF的影響 如圖2所示，與對照組相比，4%和1%氧濃度環(huán)境培養(yǎng)皮層細胞3 h，對細胞分泌VEGF無明顯影響（P＞0.05），但均有升高趨勢。當?shù)脱跆幚砑毎? h時，2個氧濃度環(huán)境均可明顯誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠皮層細胞分泌VEGF（P＜0.05），分別是其對照組的1.73倍和2.29倍。

2.3 不同低氧環(huán)境對大腦皮層細胞表達VEGF m RNA的影響 如圖3所示，4%和1%氧濃度環(huán)境處理皮層細胞3 h，不能明顯誘導(dǎo)細胞VEGF mRNA的表達（P＞0.05），但有增加的趨勢。待2個氧濃度環(huán)境培養(yǎng)皮層細胞6 h時，可明顯誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠皮層細胞VEGFmRNA的表達（P＜0.05），分別是其對照組的1.32倍和1.94倍。

2.4 相同低氧處理時間、不同低氧環(huán)境對大腦皮層細胞表達VEGF的影響 為了比較細胞在不同低氧程度下表達VEGF的影響，我們對不同條件下細胞表達VEGF的情況進行了比較（圖4），可以發(fā)現(xiàn)低氧處理細胞3 h后，在2種氧濃度環(huán)境下細胞分泌VEGF的增長率和表達VEGFmRNA的量均有升高趨勢，但無差異性（P＞0.05）。當?shù)脱跆幚砑毎? h時，與4%氧濃度相比，1%氧濃度環(huán)境能更大程度地刺激皮層細胞分泌VEGF（P＜0.05），增長率為129.14%，VEGFmRNA的表達量為4%氧濃度環(huán)境的1.47倍（P＜0.05）。

圖1 原代培養(yǎng)的大鼠皮層細胞及其表型鑒定Figure 1. The Primary Cerebral Cortex Cells of SD Rats and Its Phenotype Identification

圖2 低氧對皮層細胞分泌VEGF的影響Figure 2. Effect of Hypoxia on VEGF Protein Secretion in Cortex Cells

圖3 低氧對皮層細胞表達VEGFmRNA的影響Figure 3. Effect of Hypoxia on VEGFmRNA Expression in Cortex Cells

注：*表示P＜0.05（與H6比較）。

2.5 相同低氧環(huán)境、不同低氧處理時間對大腦皮層細胞表達VEGF的影響 如圖5所示，在4%氧濃度環(huán)境下，低氧處理細胞6 h與3 h相比，6 h更能明顯地引起皮層細胞分泌VEGF（P＜0.05），為3 h組的2.5倍。細胞VEGFmRNA的表達量比3 h組亦有升高趨勢，但無明顯差異性（P＞0.05）。在1%氧濃度環(huán)境下，低氧處理細胞6 h與3 h相比，6 h組細胞分泌VEGF和表達VEGF mRNA均有明顯升高（P＜0.01），分別為3 h組的2.85倍和1.60倍。

圖5 相同低氧濃度、不同低氧處理時間對皮層細胞表達VEGF的影響Figure 5. Effect of Hypoxia on VEGF Protein Secretion and mRNA Expression in Cortex Cells under the Same Concentration and Different Intervening Time

3 討論

作為一種刺激，適度低氧可使機體產(chǎn)生一系列生理性適應(yīng)，重度低氧則會引起病理性變化。低氧損傷的嚴重程度除了取決于低氧刺激的強度和持續(xù)時間，也取決于組織對低氧的耐受性。神經(jīng)系統(tǒng)對低氧高度敏感，神經(jīng)元又是高耗能細胞，重度低氧將會導(dǎo)致細胞能量供應(yīng)不足，造成神經(jīng)元損傷，甚至死亡。缺血性低氧可引起腦內(nèi)一些生物活性物質(zhì)表達的增加，如VEGF和BDNF等，參與低氧預(yù)適應(yīng)，其中有關(guān)VEGF的研究最多［10］。

VEGF分布于很多組織中，但常氧下表達量較低。當組織缺氧時，低氧誘導(dǎo)因子-1可通過與其下游靶基因VEGF上5'端低氧增強子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，上調(diào)VEGF的表達［11］。Wang等［12］在體實驗表明，VEGF作為缺血性低氧反應(yīng)的重要產(chǎn)物之一，缺血再灌注后大鼠大腦皮質(zhì)VEGF mRNA及其蛋白表達升高，并且腦組織VEGF表達的增加可誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生；M?g?itescu等［13］也指出，大腦缺血性損傷后，可觀察到VEGF上調(diào)于星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞等，高表達的VEGF參與了神經(jīng)營養(yǎng)與保護及神經(jīng)與血管的再生過程。對于單純低氧因素是否也同樣可以引起大腦皮層細胞表達VEGF和調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生，目前未見報道。

本研究設(shè)定了1%和4%2個低氧濃度，分別觀察低氧處理3 h和6 h后對原代培養(yǎng)SD大鼠大腦皮層細胞分泌和表達VEGF的影響，結(jié)果顯示，4%和1%氧濃度環(huán)境處理細胞6 h，細胞培養(yǎng)液中VEGF蛋白分泌量均高于常氧環(huán)境，細胞內(nèi)也出現(xiàn)了VEGFmRNA表達上調(diào)的現(xiàn)象，其中1%氧濃度環(huán)境增幅更大，說明隨著氧濃度的降低，刺激細胞表達了更多的生物活性物質(zhì)，以對低氧刺激產(chǎn)生適應(yīng)。與本研究結(jié)果一致：劉海意等［14］發(fā)現(xiàn)，缺氧6 h可明顯誘導(dǎo)原代培養(yǎng)人早孕絨毛滋養(yǎng)細胞VEGFmRNA水平升高；戴俊峰等［15］研究也表明，SD大鼠成骨細胞缺氧6 h后，VEGFmRNA水平明顯增加，說明低氧或缺氧刺激誘導(dǎo)不同類型細胞表達VEGF所需時間大致相同。至于低氧誘導(dǎo)大腦皮層組織表達和分泌VEGF的生物學(xué)意義，一方面可能是誘導(dǎo)腦內(nèi)微血管發(fā)生［16］，另一方面可能是保護神經(jīng)元［17］，還有可能是誘導(dǎo)皮層內(nèi)神經(jīng)干細胞增殖［18-19］。關(guān)于VEGF與在體神經(jīng)發(fā)生的關(guān)系，有研究認為缺血性低氧可通過誘導(dǎo)VEGF的表達，促進神經(jīng)干細胞增殖和誘導(dǎo)神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元方向分化［19-20］。同樣，運動引起的大鼠海馬齒狀回內(nèi)神經(jīng)發(fā)生也與VEGF表達水平增加密切相關(guān)［21］，而運動時腦內(nèi)葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生增加的現(xiàn)象，提示運動時大腦處于相對低氧狀態(tài)［22］。說明運動和缺血性低氧引起神經(jīng)發(fā)生的機制可能存在著相似之處，即兩者可能都是通過上調(diào)VEGF的表達影響神經(jīng)干細胞增殖和促進神經(jīng)發(fā)生。

在體外研究方面，Kim等［23］研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可明顯提高人類胚胎干細胞向神經(jīng)元方向分化的潛能。本課題組其他成員的研究結(jié)果顯示，用4%氧濃度環(huán)境下持續(xù)刺激大鼠大腦皮層細胞6 h所制備的低氧條件液（即上述細胞低氧培養(yǎng)液），培養(yǎng)皮層來源的神經(jīng)干細胞，發(fā)現(xiàn)能夠明顯促進神經(jīng)干細胞的增殖效率，且此促進作用主要通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl-inositol3-kinase，PI3/K）信號通路實現(xiàn)；1%低氧皮層細胞條件液則會抑制神經(jīng)干細胞的增殖效率。提示低氧誘導(dǎo)的皮層細胞分泌和表達VEGF在誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生方面可能具有重要意義。至于1%低氧皮層細胞條件液內(nèi)含有更高濃度的VEGF卻抑制了神經(jīng)干細胞的增殖效率，則表明重度低氧可能誘導(dǎo)細胞釋放了另外一些不利于啟動神經(jīng)干細胞增殖的物質(zhì)，如谷氨酸等［24］。這也為腦內(nèi)輕度低氧可產(chǎn)生適應(yīng)、重度低氧可損傷神經(jīng)細胞的現(xiàn)象提供了實驗依據(jù)。關(guān)于低氧誘導(dǎo)皮層細胞分泌VEGF更多來源于神經(jīng)元還是星形膠質(zhì)細胞，有待進一步研究。

4 結(jié)論

低氧可明顯誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層細胞分泌VEGF和表達VEGFmRNA，且皮層細胞的反應(yīng)性與低氧濃度、低氧刺激時間有關(guān)。同時，在低氧環(huán)境下大腦皮層細胞上調(diào)的VEGF可能在提高神經(jīng)干細胞分裂速度、調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞分化過程中發(fā)揮著重要作用。

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Effects of Hypoxia on Vascular Endothelial Grow th Factorsm RNA and Protein Expressions in CerebralCortex Cells of SD Rats

∥ZHOU Yuehui，YUAN Haiping，LOU Shujie

Objectives：It is to observe the effect on the expressions of vascular endothelial grow th factor（VEGF）mRNA and protein in cerebral cortex cells under the environment of different oxygen concentration and time treatment.Methods：The primary cerebral cortex cells of SD rats were designed into two hypoxia groups and two normoxia control groups for5 days.Then，the cells of hypoxia groupswere treated by 3 hours（3 h）and 6 hours（6 h）under the environment of 1%and 4%oxygen concentration respectively in hypoxia workstation，while the corresponding control groups remained in HHCP.The ELASA method was used to detect VEGF protein content in cultural supernatants，and the levelof intracellularVEGFmRNA was tested by RT-PCR.Results：Compared with the control groups，the levelof VEGFmRNA and protein of 3 h groups had no significant difference under the environment of 1%and 4% oxygen concentration，but w ith a rising tendency；While the level of VEGFmRNA and protein of 6 h groupshad significant rise，with a higher rise for the group under the environment of 1%oxygen concentration.Conclusions：Hypoxia can induce cerebral cortex cells of rats to produce VEGF and express VEGF mRNA；its reaction is related to the oxygen concentration and time treatment.

hypoxia；rat；cerebral cortex cell；VEGF；ELISA；RT-PCR

G804.2

A

1000 -5498（2013）05 -0068 -05

2013 -03 -18；

2013 -06 -25

國家自然科學(xué)基金資助項目（30870349）；上海市人類運動能力開發(fā)與保障重點實驗室資助項目（11DZ2261100）

周躍輝（1985 -），男，安徽亳州人，上海體育學(xué)院碩士研究生；Tel：18801930833，E- mail：msyzyh2006 @126.com

婁淑杰（1963 -），女，內(nèi)蒙古赤峰人，上海體育學(xué)院教授，博士，博士生導(dǎo)師；Tel：（021）51253243，E- mail：shujielou319@163.com