銀翹解毒顆粒等中成藥微生物限度檢查法的建立分析

姚衛紅 張麗娜 劉美秀

銀翹解毒顆粒等中成藥微生物限度檢查法的建立分析

姚衛紅 張麗娜 劉美秀

目的通過對包括銀翹解毒顆粒在內的11種樣品的實驗菌株回收率的實驗，進行中成藥微生物限度檢查法的建立分析。方法通過霉菌、細菌、酵母菌計數法的回收率測定和結果及控制菌驗證檢查方法，進行銀翹解毒顆粒等中成藥微生物限度檢查法的建立分析。結果有抑菌性能的中成藥品，多半是枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能比較強，對于白色念珠菌，均無抑菌作用。結論多數的中成藥其抑菌性能都是以阻攔陽性菌種為主，此項檢測結果可以為中成藥微生物檢查方法的研究建立提供一定的參考價值。

銀翹解毒顆粒；中成藥；微生物限度檢查

根據國家2010年版《中國藥典》要求，在對藥品微生物限度檢查時，首先應對所選取的方法進行驗證，從而確保此方法適合這類藥品的限度檢查。在進行有抑菌性能的中成藥品檢測時，因其抑菌作用的影響，如采用常規方法進行檢驗，則不能真實的反應藥品的微生物情況[1]。要先進行供試液抑菌性能的消除，再依據不同的藥品選取合適的檢查方法。再加上每種中成藥的抑菌強弱不同，這就要求在進行其抑菌性能消除時，要采取不同的方法[2]。對于銀翹解毒顆粒等多種微生物限度檢查方法的建立，會為各種類型中成藥微生物檢查方法所提供一定的科學實驗依據。

1 實驗材料

1.1 菌種大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌由四川省食品藥品檢驗所提供。

1.2 樣品三黃片，批號為120104；復方枇杷止咳顆粒，批號為120201；清火梔麥片，批號為110922；宮血寧膠囊，批號為2511019；胃康靈膠囊，批號為201112077；消炎利膽片，批號為111208；腎石通顆粒，批號為050120；板藍根顆粒，批號為110515；清開靈片，批號為2011111403；咳特寧膠囊，批號為4120002；銀翹解毒顆粒，批號為1112012。

2 方法與結果

2.1 霉菌、細菌、酵母菌計數法的回收率測定常規法，取1ml 1：100的供試液與1ml菌懸液，注入滅菌平皿里面，再倒入15ml左右的45℃瓊脂培養基。每個菌株做2.5ml。在32℃左右的培養箱中，將細菌培養48h。在25℃左右的培養箱中，將真菌培養72h，取菌落數的平均值[3]。

薄膜過濾法+離心沉淀法，取10ml 1：100供試液，放入滅菌離心管中，用450r/min離心5min后，取1ml上層液，加到100ml的稀釋液，加壓或減壓抽濾，再用300ml的稀釋溶液沖洗三次濾膜。然后，再沖洗液中加入1ml的菌懸液，過濾后取出濾膜。菌面朝上，貼于瓊脂培養基的平板基上進行培養和計數。

菌液組，測定試菌數。在按照上述方法，不加入菌液，來測定本底菌。用常規法測定樣品品種對于4個實驗菌株回收率如表1，板藍根顆粒、咳特寧膠囊、消炎利膽片、腎石通顆粒對于4個菌株回收率均高于70%，證明其無抑菌作用。清火梔麥片、胃康靈膠囊、宮血寧膠囊、清開靈片、復方枇杷止咳顆粒對于枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌作用。三黃片和銀翹解毒顆粒的抑菌效果最強，三黃片對于枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的回收率均低于10%。這些品種對于白色念珠菌均無抑制作用。

表1 常規法測定的樣品品種對于4個實驗菌株的回收率(%)

2.2 對上述有抑菌作用的品種，用培養基稀釋法進行菌株回收率的測定：由于胃康靈膠囊和宮血寧膠囊的抑菌作用較小，在兩個平皿中分別注入0.5ml的供試液（見表2），用培養基把供試液進行稀釋，可消除其抑菌性。

2.3 清火梔麥片、清開靈片、復方枇杷止咳顆粒，必須將1ml的供試液注入到5個平皿中（見表3），抑菌作用才可以忽略。

2.4 三黃片和銀翹解毒顆粒的抑菌作用非常強，將1ml供試液注入到5個平皿中，也不能完全消除其抑菌性。用薄膜過濾法＋離心沉淀法，測定三黃片和銀翹解毒顆粒的菌株回收率，可有效消除實驗條件下，三黃片和銀翹解毒顆粒對于菌株抑制的作用（見表4）。

2.5 控制菌驗證檢查方法實驗組：取規定量供試液和10～100cfu/ml的實驗菌株，加入相應的增菌培養基，再按照控制菌檢查法進行檢查。陽性對照：取10～100cfu/ml的實驗菌株，加入相應的增菌培養基，再按照控制菌檢查法進行檢查。樣品組：取規定量的供試液，加入相應的增菌培養基，然后按照控制菌檢查法進行檢查。陰性對照：取相應的稀釋液替代供試液，按相應控制菌的檢查法進行檢查。結果：實驗組檢查出試驗菌種，而陰性組則無試驗菌種出現，故此，使用的檢查方法成立。且相應檢驗結果參照表5判定。

表2 兩個平皿中分別注入0.5ml的供試液測定藥品樣品的菌株回收率(%)

表3 1ml供試液注入到5個平皿的回收率分析(%)

表4 薄膜過濾法＋離心沉淀法測定三黃片和銀翹解毒顆粒的菌株回收率(%)

表5 控制菌驗證檢查結果判定標準

2.6 微生物限度檢查法建立當枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的回收率均達到70%以上時，說明藥品中各類污染的細菌都可以順利的檢測出來，均可采用此項方法進行檢測[4]。通過上述實驗表明，這11類藥品的細菌檢查方法如下：咳特寧膠囊、板藍根顆粒、消炎利膽片、腎石通顆粒可以采用常規法進行檢查，清火梔麥片、清開靈片、復方枇杷止咳顆粒、胃康靈膠囊、宮血寧膠囊可以采用培養基稀釋方法進行檢測[5-6]，三黃片、銀翹解毒顆粒可以采用薄膜過濾法+離心沉淀法進行檢查。

3 討論

在2005年版本的《中國藥典》頒布以前，中成藥制劑中微生物的限度檢查方法一般是按照常規衛生藥品檢查方法，進行霉菌、細菌、酵母菌的技術[7]。中成藥都是復合制劑，也就是說含有多種成分，任何一種成分如果具有抑菌性，就會影響到微生物檢查限度的準確性。所以說，很多資料都探討了有抑菌性能的中成藥中微生物限度的檢測方法，但是，對于控制菌檢查和實驗菌株回收進行的驗證不多[8-9]。本文根據2010年版《中國藥典》相關規定，對于包括銀翹解毒顆粒在內的十多種中成藥進行了微生物檢查方法的驗證和建立[10]。通過實驗結果來看，對于有抑菌性能的中成藥，就可以對供試液做有關的處理，從而消除供試液的抑菌性，然后進行微生物的限度檢查，在根本上保證了結果的準確性和可靠性。針對抑菌性能較弱的中成藥，其使用培養基稀釋液的方法就比較簡便可靠。當供試液的抑菌效果較強時，用稀釋法就很難消除供試液的抑菌性，可采用薄膜過濾法、離心沉淀法等多種方法綜合使用，達到消除抑菌性能的作用，從而提高檢測的準確性，使得檢測結果能夠全面、真實地反映出藥品的實際污染情況。

通過對包括銀翹解毒顆粒在內的11種藥品的實驗菌株回收率的實驗可以看出，有抑菌性能的中成藥品，多半是枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能比較強，對于白色念珠菌沒有抑菌作用，說明大多數的中成藥其抑菌性能都是以阻攔陽性菌種為主，此項檢測結果可以為中成藥的微生物檢查方法的研究建立提供一定的參考價值。

[1] 林麗英,湛文青,饒春意.野牡丹止痢片微生物限度檢查法的建立[J].中藥材,2006(3)：299-302.

[2] 馬越,特玉香,杜平華,等.16種中成藥微生物限度檢查法方法驗證[J].中國藥品標準,2005(06)：12-15.

[3] 吳曉敏,王燕燕.8種醫院制劑微生物限度檢查方法驗證[J].中國醫院藥學雜志,2007(1)：64-66.

[4] 闞秀燕,李妍.4種中成藥微生物限度檢查法中細菌霉菌(酵母菌)計數的方法驗證[J].中華中醫藥學刊,2007(11)：14-16.

[5] 詹云麗.對影響微生物限度檢查結果若干因素的探討[J].中國藥師,2003(6)：21-23.

[6] 馬緒榮.中南協作區藥品微生物檢驗第五次專業會議在武漢市召開[J].中國藥事,1991(2)：68-70.

[7] 董潤生,蘇德模.《藥品衛生檢驗方法》(1990年版)[J].中藥新藥與臨床藥理,1992(1)：10-12.

[8] 王知堅,邵惠琴,杜蕓,等.藥品微生物限度檢查法有效性驗證實驗研究[J].中國現代應用藥學,2004(3)：211-213.

[9] 郁韞超,孫黎敏,何婭,等.對醫院制劑應用無菌檢查法和微生物限度檢查法的探討[J].藥學服務與研究,2005(2)：200-201.

[10] 劉金來,張秀華,黃學蓀.山梨酸對呋喃西林溶液穩定性的影響[J].中國藥業,2005(7)：27-28.

R927.1

A

1673-5846(2013)03-0219-03

四川省雅安市食品藥品檢驗所，四川雅安 625000