地佐辛在雌激素干擾下對切口痛大鼠痛行為學及脊髓c-fos蛋白表達的影響

陳江 程橋

隨著人們對疼痛研究的不斷深入，阿片類藥物也愈加受到關注，在對阿片類藥物鎮痛效果的大量研究中發現疼痛存在顯著性別差異，即女性的痛閾和對疼痛的耐受性明顯高于男性［1］。其中嗎啡類止痛劑以及納布啡、噴他佐辛等阿片物質的激動劑/拮抗劑的鎮痛效果存在兩性差異［2］。地佐辛是一種新型的阿片類藥物，其鎮痛效果是否存在性別差異目前備受爭議。Fos蛋白作為一種疼痛在分子水平的標志，可作為神經元興奮的標志。本實驗通過注射外源性雌激素，觀察地佐辛在雌激素干擾下對切口痛大鼠行為及脊髓c-fos蛋白表達的影響，探討雌激素對地佐辛鎮痛效果的影響。

1 資料與方法

1.1 主要藥物和試劑 17-β雌二醇購自上海博蘊生物公司，地佐辛購自揚子江藥業集團有限公司。大鼠C-fos ELISA試劑盒購于上海西塘生物科技有限公司。

1.2 實驗分組及給藥方法 健康成年雌性SD大鼠32只，重量250～280 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。將32只大鼠分為去卵巢手術組（OVX+V）、雌激素組（OVX+E）、地佐辛組（OVX+D）和雌激素+地佐辛組（OVX+E+D），各8只。雌激素組于造模前3 h皮下注射17 β-雌二醇（0.2 mg/100 g），地佐辛組于造模后尾靜脈注射地佐辛（0.1 mg/100 g）；雌激素+地佐辛組按相應的劑量以及時間點分別給予雌激素和地佐辛。

1.3 卵巢切除術 0.3%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠，腹正中切口(1～1.5 cm)，沿子宮找到雙側卵巢并結扎摘除止血，術后連續3 d肌內注射抗生素。在安靜、溫暖和避強光的環境中飼養4周。

1.4 切口痛模型的制備 大鼠于實驗前放置在安靜、溫暖和避強光的環境中飼養，將大鼠麻醉后，消毒大鼠的左側后爪，用Brennan等［3］法從足底近端0.5 cm處向趾部做1 cm長的條狀切口，切開皮膚后，用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割，保持其起止附著點的完整，紗布按壓止血后，用細線縫合皮膚。手術過程持續約5 min。

1.5 行為學觀察及評分 行為學改變主要發生在傷害性刺激后1 h，術后1 h觀察大鼠行為學改變，觀察其左側后爪及其負重情況。后爪著地且能夠負重計0分，后爪著地不負重計1分，后爪翹起不著地計2分。5 min觀察1次，每次1 min，以1 min內最常采用的姿勢為標準進行評分，共觀察1 h(0～24分)。以術側足評分減去對側足評分即為所得累積疼痛評分。

1.6 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）法檢測脊髓fos蛋白表達情況 手術刺激后2 h，取每只大鼠腰段脊髓，大鼠的下肢神經相對應的脊髓節段為腰膨大，大致包括腰髓的4～6節段，相應的位置為平胸13肋向下1 cm的范圍，即按此范圍取材，具體方法如下：（1）腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，大鼠取俯臥位固定；（2）背部正中切口剪開大鼠皮膚，分開筋膜和肌肉，暴露胸椎和腰椎；（3）于13浮肋水平向下1.5 cm咬開相應部位的棘突和椎板，充分暴露脊髓；（4）平13肋向下剪取長度約1 cm的脊髓組織；（5）將所取得脊髓組織稱重后置于勻漿緩沖液中勻漿，20000 r/min，離心30 min，取上清液待用，樣本在-70℃保存。按照試劑盒說明進行ELISA法檢測fos蛋白含量，計算脊髓組織中fos蛋白的濃度。

1.7 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行處理，所得數據均以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 累計疼痛評分 手術組大鼠均表現術側后爪翹起，偶爾著地但不負重等疼痛行為。與手術組比較，雌激素組、地佐辛組、地佐辛+雌激素組疼痛均明顯減輕（P＜0.05）；與雌激素組比較，雌激素+地佐辛組疼痛也明顯緩解（P＜0.05）；與地佐辛組比較，雌激素+地佐辛累計疼痛評分差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 四組大鼠疼痛累計評分的表達變化

2.2 脊髓c-fos蛋白表達 與手術組比較，地佐辛組，雌激素組，地佐辛+雌激素組c-fos表達量均明顯下降（P＜0.05）；與雌激素組比較，地佐辛+雌激素組c-fos表達量明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與地佐辛組比較，地佐辛+雌激素組c-fos表達量變化差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 四組大鼠脊髓c-fos蛋白的表達變化（pg/mL）

3 討論

Fos蛋白是原癌基因c-fos的表達產物，c-fos基因是一種即刻早期基因，正常情況下，在細胞內很少表達，當機體受到傷害性刺激時后能夠在中樞神經系統內不同部位表達，因此c-fos可作為神經元興奮的標志，是研究中樞神經系統最具有代表性的即刻早期基因［4］。雌激素主要通過雌激素受體來發揮作用，雌激素受體(estrogen receptors，ERs)是甾體激素受體，其廣泛分布于生殖系統、免疫系統、骨骼系統和心血管系統。目前神經解剖學研究顯示，ERs廣泛分布于痛覺傳遞和調制通路中，如背根神經節、脊髓背角、中腦導水管周圍灰質、臂旁核、脊核、下丘腦、大腦邊緣系和幾個皮質區等區域，并通過激活不同部位的雌激素受體參與痛覺的廣泛調節［5］。本實驗中我們采用Fos蛋白作為疼痛刺激的標志物，發現去卵巢大鼠給予外源性雌激素后，疼痛評分降低，c-fos表達明顯減少，再次證實雌激素可以降低或逆轉卵巢切除大鼠的增加的疼痛敏感性，起到抗疼痛過敏作用。

地佐辛是一種新型的阿片類藥物，為阿片受體混合激動-拮抗劑，為κ受體激動劑、 受體拮抗劑［6］，其安全性高，不良反應少，鎮痛滿意率高于嗎啡，實驗結果發現去卵巢大鼠和雌激素組大鼠在給予地佐辛后，疼痛評分和c-fos表達量均明顯下降，這和以前的研究結果一致，表明地佐辛確實可以發揮明顯的鎮痛作用，但是地佐辛聯合雌激素組和單用地佐辛組比較，疼痛評分和c-fos表達量變化均不明顯，其具體原因可能為：地佐辛為阿片受體混合激動-拮抗劑，而雌激素也能夠雙向影響阿片系統，首先雌激素可以通過減少L-精氨酸/NO/cGMP通路來下調κ阿片受體數量或功能，從而減弱TMJκ調節的鎮痛。其可能通過降低κ阿片受體mRNA的合成或者增加這些纖維的κ阿片受體mRNA降解來下調功能性阿片受體的數量，也可能通過增加GRKs的mRNA的轉錄，激活GRK/抑制蛋白系統從而導致κ阿片受體脫敏，減弱阿片受體的功能［7］。其次，有研究顯示雌激素可增加疼痛誘導的μ阿片受體在大腦中的結合，增加μ阿片受體的有效性，這表明外源性雌激素可增強內源性阿片系統的功能。雌二醇治療可能增加大鼠海馬和丘腦μ結合位點的數目；同時雌激素還可導致中央視前區核和后背角中央杏仁核的μ阿片受體的內化，這種內化被認為是突觸活性的標志；并雌激素還可作用于阿片受體突觸前神經元，從而增加內源性阿片肽的釋放，從而降低大鼠疼痛敏感性。大量研究還表明，在外周初級傳入傷害性感受器上，μ阿片受體、κ阿片受體和GIRK通道是共表達的，雌激素可以通過調控GIRK 2參與對阿片鎮痛的調節，但其具體機制目前尚不清楚［8］。

綜上所述，雌激素對阿片受體存在雙向調節作用，不僅可以下調κ阿片受體數量或功能，還可以增加μ結合位點的數目，而地佐辛為阿片受體混合激動-拮抗劑，地佐辛與雌激素聯合用于去卵巢大鼠，兩者對阿片受體的這種作用可能會通過多種通路相互影響，部分抵消，相互中和，最終在我們的結果中看到地佐辛的鎮痛效果并沒有受到雌激素的太多干擾。但是具體機制可能受到多重因素的影響包括藥物本身的特殊性，如劑量、藥理作用、給藥途徑和給藥時間等，還有物種、基因型、年齡和性激素周期等。

我們的結果表明，基于本實驗條件下，雌激素單獨應用對c-fos表達有一定程度抑制作用，但雌激素對地佐辛的鎮痛效果沒有明顯的影響。

［1］RileyJL,Robinson ME,Wise EA,et al.Sex differences in the perception of noxious experim ental stimuli ameta-analysis［J］.Pain,1998,74(2/3):181-187.

［2］Gear RW,Gordon NC,Heller PH,et al.Gender difference in analgesic response to the kappa-opioid pentazocine［J］.Neurosci Lett,1996,205(3):207-209.

［3］Brennan TJ,Vandermeulen EP，Gebhart GF.Characterization of a rat model of incisional pain［J］.Pain,1996，64（3）：493-501.

［4］Harris JA.Usingc fos a saneural marker of pain［J］.Brain Res Bul,1998,45(1):1-8.

［5］Evrard HC.Estrogen synthesis in the spinal dorsal horn:anewcentral mechanism for the hormonal regulation of pain［J］.AmJ Physiol Regul Integr Comp Physiol,2006,291(2):R 291-R 299.

［6］劉俊，徐越峰.地佐辛應用于瑞芬太尼靜脈麻醉術后痛覺過敏觀察［J］.中國醫療前沿，2009，4(24):15-16.

［7］Clemente-Napimoga JT,Pellegrini-da-Silva A,Ferreira VH,et al.Gonadal hormones decrease temporomandibular joint kappa-mediated antinociception through a down-regulation in the expression of kappa opioid receptors in the trigeminal ganglia［J］. EurJ Pharmacol，2009，617(1-3):41-47.

［8］Blednov YA,Stoffel M,Alva H,et al.A pervasive mechanism for analgesia:activation of GIRK-channels［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(1):277-282.