兩種防脫片劑在免疫組化染色中的應(yīng)用比較

張婉儀 胡垚 葉勇

免疫組化（IHC）是應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)顯色確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的技術(shù)，由于IHC步驟多、環(huán)節(jié)多、影響因素多，要求組織切片在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要有較高的耐受能力，避免脫片的發(fā)生，耗損人力物力，延誤了實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確診斷，故防脫片是保證病理診斷工作的關(guān)鍵[1-2]。筆者為了探討免疫組化染色中防脫片的方法，通過(guò)對(duì)50 份切片進(jìn)行處理觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 選自我院50 例經(jīng)10%中性甲醛液固定的乳腺組織、宮頸組織、前列腺組織、脫鈣骨組織、細(xì)胞塊組織、腸癌組織、淋巴組織、甲狀腺組織等，每個(gè)病例挑選同一個(gè)組織塊進(jìn)行切片兩張，分成兩組。對(duì)照組50 張切片，觀察組50 張切片。兩組標(biāo)本比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器和試劑盒 免疫組化試劑盒、多聚賴氨酸、APES由北京中杉金橋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 防脫玻片的制備 選擇同一批高清潔度免洗載玻片。對(duì)照組處理方法： 將載玻片浸泡在2%的APES無(wú)水乙醇溶液中1～2 min，再分別在無(wú)水乙醇（Ⅰ）（Ⅱ）（Ⅲ）浸洗1～2 min，洗去未結(jié)合的APES，置60℃烤干1 h，備用。觀察組處理方法：將載玻片浸泡在0.01%多聚賴氨酸水溶液中5 min，取出置60℃烤干1 h或室溫晾干備用。

1.3.2 切片 組織塊經(jīng)脫水包埋后，連續(xù)切片2 張，厚4 μm，分別用APES及多聚賴氨酸玻片撈片，置65℃烤箱烤片2～3 h。

1.3.3 顯色 切片脫蠟至水，蒸餾水洗，PBS洗，分別采用高壓鍋熱修復(fù)、微波熱修復(fù)和胃酶消化3 種抗原修復(fù)方式后，PBS洗3 min/2 次，H2O2室溫10 min，PBS洗5 min/2 次，山羊血清室溫封閉30 min，PBS洗5 min/2 次，滴加一抗抗體并4℃孵育過(guò)夜，PBS洗5 min/3 次，滴加相應(yīng)二抗，37℃孵育15 min，PBS洗5 min/3 次，滴加相應(yīng)三抗，37℃孵育15 min，PBS洗5 min/3 次，加DAB顯色液，自來(lái)水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.4 脫片判斷標(biāo)準(zhǔn) 輕度脫片：切片邊緣輕度卷曲至脫落面積＜10%；中度脫片：10%＜切片脫落面積＜80%；重度脫片：切片脫落面積＞80%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組完整貼片率為100%，對(duì)照組完整貼片率為92%，觀察組完整貼片率優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組脫片情況比較

3 討論

由于病理組織常規(guī)使用的甲醛固定劑可以造成蛋白質(zhì)的交聯(lián)，即在氨基酸分子間形成亞基橋從而造成部分或大部分抗原結(jié)合位點(diǎn)（抗原決定族）的封閉，通過(guò)抗原熱修復(fù)可以使抗原結(jié)合位點(diǎn)重新暴露[3]，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度。免疫組化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，步驟多、環(huán)節(jié)多，通常會(huì)用到高壓熱修復(fù)、微波熱修復(fù)和酶消化等方式進(jìn)行抗原修復(fù)，防止組織因高溫、高壓和酶消化等的外力作用而出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，是保證及時(shí)準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要條件。

本研究結(jié)果顯示，多聚賴氨酸防脫劑有理想效果，多聚賴氨酸其分子結(jié)構(gòu)中所具有的多個(gè)陽(yáng)離子集團(tuán)與組織上陰離子相互作用會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的粘合力，可有效防止免疫組化、原位雜交等過(guò)程中的脫片現(xiàn)象[4-6]。采用浸泡方法進(jìn)行多聚賴氨玻片的制備，可以使多聚賴氨酸水膜在玻片均勻分布，通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的浸泡，使玻片表面充分與試劑接觸，產(chǎn)生良好的防脫片效果[7]。組織粘附于玻片后完全可以耐受多重物理化學(xué)環(huán)境劇變，可運(yùn)用于常規(guī)免疫組化、冷凍免疫組化、分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)等，且易于標(biāo)準(zhǔn)化制作，操作簡(jiǎn)單，節(jié)約試劑。

筆者認(rèn)為免疫組化防脫片還應(yīng)注意幾點(diǎn)：(1)在進(jìn)行多聚賴氨酸浸泡過(guò)程中容器應(yīng)選擇塑料制品，避免玻璃器皿；(2)烤片時(shí)間以1 h為宜，不可過(guò)久，烤干即可；(3)多聚賴氨酸工作液不使用時(shí)置于4℃環(huán)境保存，同批工作也循環(huán)使用次數(shù)不超過(guò)3 次，保留時(shí)間短于1 個(gè)月。

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