鹽酸表柔比星長(zhǎng)循環(huán)磁性脂質(zhì)體的制備及表征

方瑜，陳進(jìn)，吳詢燊，吳修艮，姜德立，陳敏，謝吉民

(1.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇吉貝爾藥業(yè)有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212009)

鹽酸表柔比星(EPI)是一種廣譜的蒽環(huán)類化療藥物，抗癌譜廣，療效顯著，可治療多種腫瘤。但該藥嚴(yán)重的毒副作用，尤其是嚴(yán)重的心臟損害、骨髓抑制等不良反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用［1］。脂質(zhì)體是將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊，可以有效保護(hù)被包裹藥物、提高藥物的治療指數(shù)、減少藥物的治療劑量、降低藥物的毒副作用、減輕變態(tài)反應(yīng)及免疫反應(yīng)并延緩藥物釋放［2－3］。研究結(jié)果表明，脂質(zhì)體包裹EPI的毒性比游離藥物的毒性降低50% ～70%［4］。磁性脂質(zhì)體是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外大力研究的一種新型靶向制劑，這種制劑可使藥物同時(shí)具有生物功能、磁靶向功能和治療功能，因此具有更大的應(yīng)用前景［5－8］。但是目前的磁性脂質(zhì)體大多存在著許多不可避免的缺點(diǎn)，例如體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短，物理和化學(xué)穩(wěn)定性不足，囊泡表面缺少靶向位點(diǎn)及水溶液中分散性不好等，因此開(kāi)發(fā)一種具有優(yōu)良性能的磁性脂質(zhì)體勢(shì)在必行。

本研究以聚乙二醇單甲醚(mPEG)為修飾膜材，采用乙醇注入－硫酸銨梯度法制備mPEG化EPI磁性脂質(zhì)體，并對(duì)其進(jìn)行表征;采用葡聚糖凝膠柱－紫外法測(cè)定脂質(zhì)體中EPI的包封率，并考察制備條件對(duì)EPI包封率的影響，得到最佳制備條件;進(jìn)一步研究該脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和緩釋效果。旨在為EPI系列新制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

聚乙二醇單甲醚(mPEG)(阿拉丁試劑公司);膽固醇(生工生物工程有限公司);卵磷脂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);注射用鹽酸表柔比星(浙江海正藥業(yè)有限公司);氯化鐵、氯化亞鐵、氯仿、異丙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、硫酸銨均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市英峪予華儀器廠);電動(dòng)攪拌器JJ-1(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠);氣浴恒溫振蕩器(金壇市醫(yī)療器械廠);Nexus 470 FT-IR光譜儀(美國(guó)Nicolet公司);Philips Tecnai-12透射電子顯微鏡(荷蘭Philips公司);UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.2 方法

1.2.1 Fe3O4納米顆粒的制備和表征 在攪拌條件下，將0.5 g氯化鐵和0.17 g氯化亞鐵加入150 mL除氧的蒸餾水中，緩慢滴入2 mol/L的氨水，待反應(yīng)物變?yōu)楹谏螅{(diào)節(jié)pH為9～10，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下80℃回流2 h。反應(yīng)結(jié)束后，蒸餾水洗滌2～3次，最終產(chǎn)物分散于無(wú)水乙醇中。

采用透射電鏡(TEM)觀察所制得Fe3O4納米顆粒的形貌和粒徑。

1.2.2 mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的制備和表征 按比例稱量卵磷脂、膽固醇、mPEG和Fe3O4，超聲溶于15 mL無(wú)水乙醇，用1 mL注射器將混合液緩慢注入裝有25 mL硫酸銨溶液的圓底燒瓶中，水浴超聲30 min，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至無(wú)明顯乙醇味，制得空白脂質(zhì)體。將空白脂質(zhì)體裝入透析袋中，用PBS溶液透析24 h。透析后的空白脂質(zhì)體中加入一定量預(yù)熱過(guò)的 EPI溶液，置于55℃水浴孵化30 min，用兩層微孔濾膜(超強(qiáng)型，上海密粒膜分離技術(shù)有限公司)過(guò)濾，控制脂質(zhì)體大小，并濾去未包封住的顆粒，即得磁性EPI脂質(zhì)體，4℃保存。

采用透射電鏡觀察所制得磁性EPI脂質(zhì)體的形貌和粒徑;通過(guò)外加磁場(chǎng)的作用，考察所制得磁性EPI脂質(zhì)體的體外磁響應(yīng)性;通過(guò)紅外光譜分析，研究mPEG對(duì)所制得的磁性EPI脂質(zhì)體的修飾效果。

1.2.3 mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體中EPI包封率的測(cè)定

1.2.3.1 回歸方程 稱取EPI標(biāo)準(zhǔn)品適量，以PBS為溶劑配置0.2 mg·mL－1的儲(chǔ)備液，分別配成0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg·mL－1的 EPI 標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最高吸收波長(zhǎng)(232 nm)下測(cè)定光密度(D)值，將D值與質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.3.2 包封率的測(cè)定 取1 mL mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體混懸液加到葡聚糖 G-50凝膠柱上，用PBS溶液以1 mL·min－1的流速洗脫，于最高吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外光譜檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果繪制洗脫曲線。

收集形成洗脫曲線的第1峰的洗脫液，得到除去游離EPI的含藥脂質(zhì)體溶液，加入異丙醇-鹽酸(V∶V=9∶1)混合液使脂質(zhì)體完全破裂，用紫外分光光度計(jì)于最高吸收波長(zhǎng)處測(cè)定光密度，按照葡聚糖凝膠柱-紫外法(Sephadex-UV)測(cè)定mPEG化磁性EPI納米脂質(zhì)體的包封率。包封率的計(jì)算公式如下:

其中E為包封率，C1為1 mL樣品中EPI包封量，C2為1 mL樣品中EPI總量。

1.2.4 體外穩(wěn)定性和緩釋效果試驗(yàn) 測(cè)定所制備的mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體樣品中EPI的包封量C1后，將樣品置于37℃氣浴恒溫振蕩器中，振蕩速度 100 r·min－1，分別于 0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h取樣1 mL，測(cè)定脂質(zhì)體內(nèi)EPI的包封量C2。按下列公式計(jì)算EPI釋放率(R):

根據(jù)EPI釋放率的變化情況，評(píng)價(jià)所制得EPI長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的體外穩(wěn)定性和緩釋效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米Fe3O4形貌和粒徑

圖1為所制備的Fe3O4納米粒子的TEM照片。由圖1可見(jiàn)，產(chǎn)物Fe3O4納米粒子為近球形顆粒，平均粒徑約為20 nm，粒度均勻性良好，無(wú)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象。

圖1 Fe3O4納米粒子的TEM照片F(xiàn)ig 1 TEM micrograph of Fe3O4nanoparticles

2.2 mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體形貌和粒徑

取適量脂質(zhì)體，以PBS稀釋至較低濃度，超聲分散均勻，滴于銅網(wǎng)上，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的磷鎢酸負(fù)染，透射電鏡下觀察產(chǎn)物形貌。圖2為所制備的EPI磁性脂質(zhì)體的透射電鏡照片，可以明顯看出，所制得的mPEG修飾EPI磁性脂質(zhì)體粒徑約50 nm，近球形;Fe3O4粒子被包覆于脂質(zhì)體膜內(nèi)，包覆的磁性顆粒的尺寸大于未被包覆的Fe3O4納米顆粒，可能是由于Fe3O4粒子團(tuán)聚所致。

圖2 mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的TEM照片F(xiàn)ig 2 TEM micrograph of mPEG modified magnetic long-circulating EPI liposomes

2.3 mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體體外磁響應(yīng)性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。原本均勻分散在PBS溶液中的磁性脂質(zhì)體(圖3a)在3 min內(nèi)迅速聚集在磁鐵一側(cè)(圖3b)，表明所制備的mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體具有良好的磁響應(yīng)性。

圖3 mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體被外磁場(chǎng)吸引Fig 3 The photo of mPEG modified magnetic long-circulating EPI liposomes in vitro magnetic induction

2.4 紅外光譜分析

紅外光譜圖見(jiàn)圖4。經(jīng)對(duì)比，c中3 400 cm－1左右的寬扁峰是羥基的伸縮振動(dòng)峰，2 900 cm－1左右的峰對(duì)應(yīng)mPEG的—CH2CH2O—單元中的亞甲基碳?xì)湮辗澹? 750 cm－1處的中等強(qiáng)度吸收峰是羰基的振動(dòng)吸收峰，1 100 cm－1代表C—O醚鍵的伸縮振動(dòng)，可以初步表明形成了mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體。

圖4 mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的紅外譜圖Fig 4 Fourier transform infrared(FTIR)absorption spectra of mPEG modified magnetic long-circulating EPI liposomes

2.5 mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的包封率

采用葡聚糖凝膠柱-紫外法測(cè)定脂質(zhì)體中EPI的包封率。由實(shí)驗(yàn)得到EPI的回歸方程為 A=8.659 26C+0.055 87，r2=0.999 4。

圖5為游離EPI和mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的洗脫曲線。由于游離EPI微粒本身直徑小，易分散在葡聚糖凝膠間隙，因此過(guò)柱時(shí)間長(zhǎng);而mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體微粒直徑較大，過(guò)柱時(shí)間短，先被洗脫，這樣就實(shí)現(xiàn)了兩者較好的分離。曲線中第1個(gè)波峰對(duì)應(yīng)先洗脫下來(lái)mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的量，而第2個(gè)波峰對(duì)應(yīng)后洗脫下來(lái)游離EPI的量。從洗脫曲線中可以看出，游離EPI的洗脫體積為100～130 mL，而mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的洗脫體積為8～12 mL，說(shuō)明凝膠柱可確保脂質(zhì)體和游離EPI的完全分離，且無(wú)柱吸附現(xiàn)象。

圖5 游離EPI和mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的洗脫曲線Fig 5 Elution curve of the free EPI and mPEG modified magnetic long-circulating EPI liposomes

2.6 影響EPI包封率的因素

2.6.1 水浴孵化時(shí)間對(duì)包封率的影響 孵化時(shí)間對(duì)mPEG化EPI磁性脂質(zhì)體包封率的影響見(jiàn)圖6。制備條件:溶劑為無(wú)水乙醇(15 mL);m(卵磷脂):m(膽固醇)=5∶1;m(EPI)=0.55 mg;m(mPEG)=0.02 g。

圖6 水浴孵化時(shí)間對(duì)包封率的影響Fig 6 Effects of incubation time in water bath on encapsulation efficiency of EPI

圖6表明，mPEG化EPI磁性脂質(zhì)體的包封率先隨水浴孵化時(shí)間的增長(zhǎng)而提高，當(dāng)孵化時(shí)間為30 min時(shí)，EPI脂質(zhì)體的包封率達(dá)到最大值57.5%，再繼續(xù)增長(zhǎng)水浴孵化時(shí)間，mPEG化EPI磁性脂質(zhì)體的包封率基本保持不變。

2.6.2 卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)包封率的影響卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)包封率的影響如圖7所示。制備條件:溶劑為無(wú)水乙醇(15 mL);m(EPI)=0.55 mg;m(mPEG)=0.02 g;t=30 min。

圖7 卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)包封率的影響Fig 7 Effects of mass ratio of lecithin to cholesterol on encapsulation efficiency of EPI

圖7顯示，mPEG化EPI磁性脂質(zhì)體的包封率先隨卵磷脂質(zhì)量比的增加而提高，當(dāng)m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=5∶1時(shí)，EPI脂質(zhì)體的包封率達(dá)到最大值57.5%，再繼續(xù)增加卵磷脂用量，mPEG化EPI磁性脂質(zhì)體的包封率反而降低。這可能是由于膽固醇是脂質(zhì)體膜的一種收緊劑，當(dāng)卵磷脂與膽固醇的比例合適時(shí)，脂質(zhì)體膜會(huì)比較致密，內(nèi)水相中的藥物才能不滲漏出來(lái)。當(dāng)卵磷脂用量過(guò)大時(shí)，膽固醇無(wú)法使其充分形成穩(wěn)定致密的磷脂膜，反而降低了包封率。

2.6.3 EPI用量對(duì)包封率的影響 圖8為EPI用量對(duì)包封率的影響。制備條件:溶劑為無(wú)水乙醇(15 mL);m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=5∶1;m(mPEG)=0.02 g;t=30 min。從圖8可以看出，mPEG化EPI磁性脂質(zhì)體的包封率先隨EPI用量的增加而提高，當(dāng)EPI用量為0.55 mg時(shí)，EPI脂質(zhì)體的包封率達(dá)到最大值57.5%，再繼續(xù)增加EPI用量，EPI脂質(zhì)體的包封率反而降低。這可能是由于EPI溶液呈弱堿性，大量的EPI溶液降低了原本的硫酸銨梯度，隨著內(nèi)外水相的硫酸銨梯度減小，產(chǎn)生的pH梯度和驅(qū)動(dòng)力越小，EPI進(jìn)入內(nèi)水相的量也越小，包封率越低。

圖8 EPI用量對(duì)包封率的影響Fig 8 Effects of EPI dosage on encapsulation efficiency of EPI

2.6.4 mPEG用量對(duì)包封率的影響 mPEG用量對(duì)EPI磁性脂質(zhì)體包封率的影響見(jiàn)圖9。制備條件:溶劑為無(wú)水乙醇(15 mL);m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=5 ∶1;m(EPI)=0.55 mg;t=30 min。

圖9 mPEG用量對(duì)包封率的影響Fig 9 Effects of mPEG amount on encapsulation efficiency of EPI

圖9顯示，所制得脂質(zhì)體的包封率先隨mPEG用量的增加而提高，當(dāng) mPEG用量為0.02 g時(shí)，mPEG化EPI磁性脂質(zhì)體的包封率達(dá)到最大值57.5%，再繼續(xù)增加EPI用量，脂質(zhì)體的包封率降低。這是由于mPEG具有疏水性長(zhǎng)鏈，能插入脂質(zhì)體膜，而親水端伸展于脂質(zhì)體的表面，由于這種物質(zhì)本身的成膜性差，在脂質(zhì)體膜中所占的比例過(guò)大時(shí)，會(huì)破壞脂質(zhì)體膜的穩(wěn)定性，從而降低脂質(zhì)體對(duì)水溶性物質(zhì)的包封率。

2.6.5 不同溶劑對(duì)包封率的影響 為觀察不同溶劑對(duì)mPEG化EPI磁性脂質(zhì)體包封率的影響，我們分別使用氯仿、二氯甲烷、無(wú)水乙醇和乙醚作為溶劑，制備條件:m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=5∶1;m(EPI)=0.55 mg;t=30 min;溶劑15 mL。結(jié)果氯仿、二氯甲烷、無(wú)水乙醇和乙醚作為溶劑，mPEG化EPI磁性脂質(zhì)體包封率分別為52.3%，46.5%，57.5%和24.1%。

可見(jiàn)無(wú)水乙醇作溶劑時(shí)包封率最好，可達(dá)到57.5%，同時(shí)，無(wú)水乙醇與其他溶劑相比，無(wú)毒，低廉。因此本實(shí)驗(yàn)選擇無(wú)水乙醇作為溶劑。

2.7 mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的緩釋效果

圖10為mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的體外釋放曲線，可以看出，EPI藥物在0.5 h的釋藥率即達(dá)到了24.8%，1 h后釋藥率達(dá)到44.8%，2 h的釋藥率為60.3%。隨后，mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的釋藥率緩慢減慢，4 h后維持在55.0%左右。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所制備的mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體具有優(yōu)良的緩釋效果。

本實(shí)驗(yàn)采用PBS溶液作為釋放介質(zhì)，考察了mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的緩釋效果，因?yàn)镻BS(pH=7.4)液與血液pH值相同。以上結(jié)果同時(shí)表明，mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體在PBS液具有良好的緩釋效果，但其血漿釋放度和藥物代謝動(dòng)力學(xué)及生物利用度有待進(jìn)一步研究。

圖10 mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體的體外釋放曲線Fig 10 Release profiles of EPI at pH 7.4 in PBS solution

3 結(jié)論

磁性長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體與其他納米磁性藥物載體相比，盡管制備較復(fù)雜，成本較高，但對(duì)藥物具有高包封和明顯的長(zhǎng)效緩釋效果［9－10］。而且與其他抗癌藥物制劑相比，應(yīng)用脂質(zhì)體包裹化療藥物后，能顯著減輕藥物的毒副作用，提高化療藥物的療效指數(shù)，且脂質(zhì)體為納米生物膜，毒性低，與人體組織細(xì)胞有很好的生物相容性。

本研究以沉淀法制備納米磁性Fe3O4為磁核，聚乙二醇單甲醚(mPEG)為修飾劑，采用乙醇注入法制備空白mPEG化磁性脂質(zhì)體，硫酸銨梯度法包覆EPI，制備了mPEG化EPI納米磁性長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以無(wú)水乙醇為溶劑(15 mL)，m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=5 ∶1，m(EPI)=0.55 mg，m(mPEG)=0.02 g時(shí)，制備的mPEG化EPI納米磁性脂質(zhì)體體顆粒為近球形，平均粒徑約為50 nm，藥物包封率達(dá)到57.5%，磁響應(yīng)性和緩釋效果均良好。作為一種新型藥物制劑，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，納米磁性長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體必將會(huì)有廣闊的發(fā)展前景。

［1］ 吳燕，吳誠(chéng)，梅興國(guó)，等.鹽酸表柔比星長(zhǎng)循環(huán)熱敏凍干脂質(zhì)體的處方工藝研究與體外釋藥機(jī)制探討［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2010，34(2):134－145.

［2］ 施靖，王紅芳.脂質(zhì)體作為藥物載體的研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，5(11):29－30.

［3］ 陳婧，韓美華，季字彬，等.脂質(zhì)體及傳遞體的研究概況［J］.中國(guó)醫(yī)藥技術(shù)經(jīng)濟(jì)與管理，2009，3(8):70－73.

［4］ Budai M，Szógya M.Liposomes as drug carrier systems.Preparation，classification and therapeutic advantages of liposomes［J］.Acta Pharm Hung，2001，71(1):114 －118.

［5］ Pradhan P，Giri J，Banerjee R，et al.Preparation and characterization of manganese ferrite-based magnetic liposomes for hyperthermia treatment of cancer［J］.J Magn Magn Mater，2007，311(1):208 －215.

［6］ Hirao K，Sugita T，Kubo T，et al.Targeted gene delivery to human osteosarcoma cells with magnetic cationic liposomes under a magnetic field ［J］.Int J Oncol，2003，22(5):1065－1071.

［7］ Zheng X，Lu J，Deng L，et al.Preparation and characterization of magnetic cationic liposome in gene delivery［J］.Int J Pharm，2009，366(1/2):211－217.

［8］ Dandamudi S，Campbell RB.Development and characterization of magnetic cationic liposomes for targeting tumor microvasculature ［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1768(3):427－438.

［9］ Lee H，Lee E，Kim do K，et al.Antibiofouling polymer-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles as potential magnetic resonance contrast agents for in vivo cancer imaging［J］.J Am Chem Soc，2006，128(22):7383－7389.

［10］ Yi DK，Lee SS，Papaefthymiou GC，et al.Nanoparticle architectures templated by SiO2/Fe2O3nanocomposites［J］.Chem Mater，2006，18(3):614 －619.