β－catenin和MMP－2在非小細胞肺癌中的表達及意義

孔康寶，李光虎，楊 波，崔永生

（吉林大學第一醫院 胸外科，吉林 長春130021）

肺癌作為一種惡性腫瘤，其發病率和死亡率近年來一直呈上升趨勢，并且死亡率已成為各種腫瘤之首。肺癌的發生是多因素、多基因、多階段共同參與的結果，其中細胞信號Wnt途徑轉導對其發生、發展起著至關重要的作用。近年來研究中發現在腫瘤細胞中β－catenin的異常蓄積，且其異常蓄積的程度與腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移有關。MMP－2（matrix metalloproteinase－2，基質金屬蛋白酶－2）是基質金屬蛋白酶家族成員之一，其主要通過降解細胞外基質中的膠原蛋白（主要是IV型膠原蛋白）促進腫瘤細胞轉移。目前關于MMP－2在肺癌組織中的表達情況及其與β－catenin的相互關系的研究甚少，為此，本實驗對肺鱗癌和肺腺癌及正常肺組織中的β－catenin和MMP－2的表達情況進行研究，并分析二者與臨床病理因素的關系，以探討它們在肺癌發生發展中的作用與意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2012年4月至8月在吉林大學第一醫院胸外科手術切除的肺癌組織標本，對其中資料完整的39例進行研究，術前均未進行放化療。其中，男性27例，女性12例，年齡43－76歲，平均年齡59歲；經病理證實的鱗癌19例，腺癌20例；有淋巴結轉移者18例，無淋巴結轉移者21例；腫物大小＜3cm×3cm×3cm者12例，≥3cm×3cm×3cm者27例；另取8例正常肺組織作為對照。

1.2 主要試劑 β－catenin鼠抗人單克隆抗體及免疫組化試劑盒和MMP－2單克隆抗體及免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法 標本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片，經脫蠟、脫苯、水化后，采用鏈菌素抗生物素蛋白－過氧化物酶免疫組化法（S－P法）檢測 β－catenin蛋白表達。以 0.01%mol／L PBS代替一抗作為陰性對照。已知陽性肺癌組織作陽性對照。

1.4 結果判定 β－catenin蛋白棕黃色顆粒定位于胞膜和胞質。有棕黃色顆粒為＋，無棕黃色顆粒為－。MMP－2棕黃色顆粒主要定位于癌細胞胞質中，間質細胞內亦有不同程度的表達。有棕黃色顆粒為＋，無棕黃色顆粒為－。

1.5 結果統計 通過整理染色標本的臨床資料、病理資料并將其與細胞計數結果錄入Excel和SPSS表格，我們用SPSS13.0軟件對實驗結果進行統計學分析（不同臨床病理特征比較采用χ2檢驗和Fisher精確概率法檢驗，表達相關性采用Spearman等級相關分析）。

2 結果

2.1 β－catenin的表達及其與不同臨床病理特征之間的關系

β－catenin蛋白棕黃色顆粒定位于胞膜和胞質。β－catenin在肺癌組織中的胞質表達明顯高于對照組，差異具有顯著性（P＜0.05，表1，圖1）。肺癌組織中β－catenin的表達與患者性別和年齡、腫物大小之間的差異均無顯著性（P＞0.05），在 N1－2組和N0組肺癌組織中的表達差異亦無顯著性（P＞0.05）；但肺鱗癌組織中β－catenin的胞質表達低于肺腺癌，胞膜表達高于肺腺癌，差異具有顯著性（P＜0.05，表2）。

表1 肺癌與正常對照組β－catenin和MMP－2胞質表達的關系

圖1 A肺鱗癌組織中β－catenin的表達 B肺腺癌組織中β－catenin的表達 C對照組中β－catenin的表達（均×400）

2.2 MMP－2的表達及其與不同臨床病理特征之間的關系

MMP－2棕黃色顆粒主要定位于癌細胞胞質中，間質細胞內亦有不同程度的表達。和β－catenin一樣，MMP－2在肺癌組織中的胞質表達明顯高于對照組，差異具有顯著性（表1，圖2）。在肺癌組織中，MMP－2的表達與患者性別和年齡、肺癌組織類型、腫物大小無關（P＞0.05）；但 N1－2肺癌組 MMP－2的表達明顯高于N0肺癌組，差異具有顯著性（P＜0.05，表3）。

表2 肺癌組織臨床病理特征與β－catenin表達的關系

圖2 D肺鱗癌組織中MMP－2的表達 E肺腺癌組織中MMP－2的表達 F對照組中MMP－2的表達（D、E×400，F×200）

表3 肺癌組織臨床病理特征與MMP－2胞質表達的關系

2.3 肺癌組織中β－catenin與 MMP－2表達之間的關系

采用Spearman等級相關檢驗對肺癌組織中βcatenin與MMP－2表達之間的關系進行分析，發現二者不具有相關關系（P＞0.05，表4）。

表4 肺癌組織中β－catenin與MMP－2表達之間的關系

3 討論

肺癌的發病機制復雜，是多因素參與、多階段發展的過程，其轉移是腫瘤細胞與細胞外基質相互作用的復雜的、多步驟的連續過程［1］。在諸多相關基因中，β－catenin在細胞間黏附和細胞內增殖信號轉導過程中起雙重作用［2］，一方面，它在上皮鈣粘粘素—連環素復合體（E－cad－cat complex）中發揮橋梁作用，其一端與E－cadherin的細胞漿區結合，另一端與α－cadharin結合，而后者又與細胞內的肌動蛋白骨架系統相連，從而構成一套完整的細胞黏附系統，其主要功能是保持上皮組織的完整性，防止腫瘤細胞離散、脫落起重要作用。另一方面，β－catenin也是Wnt／β－catenin信號傳導通路中的關鍵分子［3］。當Wnt信號存在時，Wnt蛋白與卷曲蛋白胞外區結合，在輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5和6協同作用下，胞質中Dsh蛋白被募集至胞膜下，使糖原合酶激酶3β磷酸化失活并從軸蛋白上脫落，則βcatenin不能被降解，大量游離的β－catenin在胞質中聚集并進入胞核內與轉錄因子T細胞因子／淋巴細胞增強因子結合，導致 Wnt靶基因（c－myc，cyclinD1等）的轉錄，繼而導致細胞異常增殖和腫瘤的發生。

近年來，一系列研究證實，Wnt通路在腫瘤發生中起到重要作用，由于β－catenin在細胞黏附和增殖過程中的雙重作用，其表達異常對很多腫瘤的發生和發展具有重要的促進作用［4－7］。目前國內外已有許多實驗［8－11］都表明肺癌組織中β－catenin異常表達與非小細胞肺癌的分化、分期、轉移密切相關。Retera等［10］的研究顯示，β－catenin的膜表達水平降低與肺癌的淋巴結轉移有關，可作為具有統計學意義的預后分子。最近由Xi－Qing Li等［12］報道的文獻中，顯示胞膜低表達β－catenin的肺癌患者生存率較正常表達者為低，且檢測β－catenin的胞質或胞核的異位表達對非小細胞肺癌具有重要臨床意義。βcatenin異常表達的原因很多，其中β－catenin基因外顯子3的突變是很多腫瘤中β－catenin異常蓄積的重要原因。β－catenin基因第三外顯子包含Ser29、Ser33、Ser37、Thr41、Ser45等突變熱點密碼子。這些密碼子編碼的絲（蘇）氨酸能夠直接被GSK－3β磷酸化，因此，這些位點的突變可影響βcatenin的降解，導致游離的β－catenin蓄積，引起細胞異常增殖。但是，徐洪濤［11］等對53例NSCLC標本β－catenin基因第3外顯子進行了PCR擴增及測序，均未發現突變，證明β－catenin基因第3外顯子的突變在NSCLC中很少見。這些結果表明，在NSCLC中β－catenin基因第3外顯子的突變不是βcatenin異常表達的主要原因。β－catenin降解過程中任何異常都有可能造成β－catenin在胞質中的蓄積。

本實驗研究結果表明，肺癌胞質中β－catenin表達明顯高于對照組，這說明β－catenin作為Wnt信號傳導通路中的關鍵分子，在胞質中的異常表達可能對肺癌的發生具有促進作用?；颊咝詣e、年齡、腫物大小及淋巴結轉移與肺癌組織中β－catenin的表達無關，這與部分文獻描述一致［13］。但我們發現βcatenin在N1－2肺癌組和N0肺癌組中的表達差異無顯著性，與相關文獻描述不符［8－10］，不過 N1－2肺癌組有高胞質表達和低胞膜表達的趨勢，其差異無顯著性是否與樣本量較少有關有待進一步研究。另外，肺鱗癌β－catenin的胞質表達低于肺腺癌，胞膜表達高于肺腺癌。肺癌細胞胞質及胞膜中β－catenin的表達高低與腫瘤的分化程度及腫瘤的轉移傾向有關，本研究中對肺腺癌及鱗癌未進行病理分化分級，并且未進行術后隨訪，因此其胞質及胞膜表達差異是否與肺癌的組織學類型有關需要在進一步的研究中有待分析。

基質金屬蛋白酶（MMPs）是一類鋅離子依賴的細胞外蛋白水解酶，可降解基底膜，促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移。許多疾病如骨關節炎、多發性硬化、腫瘤等都伴隨著 MMPs活性的改變，其中以MMPs在惡性腫瘤侵襲轉移中的作用最引人注目［14］。MMP－2（matrix metalloproteinase－2，基質金屬蛋白酶－2）是所有MMPs中分布最廣的，當細胞惡變時，常有 MMP－2的升高［15］，其主要通過降解細胞外基質中的膠原蛋白（主要是IV型膠原蛋白）促進腫瘤細胞轉移［16］，許多實驗已經證實 MMP－2在NSCLC 中 表 達 異 常［17－19］。 李 紅 梅 等［20］的 研 究 顯示，轉移能力相對較高的細胞系產生MMPs的能力強于轉移能力相對較低的細胞系。MMP－2通過對細胞外基質及基底膜中Ⅳ型膠原的特異性降解，使腫瘤細胞浸潤能力增強，發生轉移的可能性增加。Suzuki等［21］用酶譜法和免疫組織化法在檢測NSCLC組織中MMP－2和MMP－9的表達水平，結果MMP－2較MMP－9有更強的表達，故認為在肺癌中，MMP－2較MMP－9充當更重要的角色。

本實驗證實，N1－2肺癌組 MMP－2的表達明顯高于N0肺癌組，亦即MMP2的表達與NSCLC的淋巴結轉移正相關，這與大多文獻報道相同［22］。此外，MMP－2的表達與患者性別和年齡、肺癌組織類型、腫物大小無顯著性差異也與文獻描述相同［23］。本實驗標本量不多，隨訪中部分病例失訪，并且沒有到3年及5年隨訪時間，很難進行有效隨訪統計。我們將在隨后的大樣本實驗中做進一步完善。

我們還對肺癌組織中β－catenin胞質表達和胞膜表達與MMP－2表達之間的關系分別進行相關性分析，結果顯示，β－catenin胞質表達和胞膜表達與MMP－2表達之間均無相關關系（P＞0.05），這一結果可能與本研究中肺鱗癌及肺腺癌組織樣本量較少有關，需要在后期研究中通過大樣本實驗來進一步證實。田素芳［24］等的研究顯示，胃腺癌組織中MMP－2的表達與β－catenin的膜表達呈負相關，與本實驗結果相矛盾。據文獻表述，β－catenin胞質表達異常增強與腫瘤的發生和侵襲有關，但其胞膜表達下調與腫瘤淋巴結及遠隔轉移的關系尚未得到確證［25］。MMP－2的作用靶點主要是IV型膠原蛋白，而在正常細胞中，β－catenin則通過參與構成上皮鈣粘素—連環素復合體（E－cad－cat complex）限制腫瘤細胞的侵襲和轉移。MMP－2表達上調和β－catenin胞膜表達缺失可能協同參與腫瘤細胞的轉移過程，但二者之間的相關關系缺乏理論和實驗數據支持。

綜上所述，β－catenin和 MMP－2在肺癌的發生、發展和轉移過程中均起到了不同程度的作用：βcatenin胞質表達上調激活Wnt信號轉導途徑，促進細胞增殖，抑制細胞分化，從而加速肺癌的發生和發展；MMP－2表達增強促進細胞外基質的破壞，因此提高了腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。MMP－2表達上調和β－catenin胞膜表達下調可能協同參與腫瘤細胞的轉移過程，二者在肺癌轉移過程中的作用是相加作用還是協同增強作用需要進一步研究及探討。

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