BRCA－1、ERCCmRNA表達水平與在大腸癌鉑類化療預后的相關性研究

劉燕文，魯 凱，賈建英，葉紅玲，姜維美

（連云港市第二人民醫院 腫瘤內科，江蘇 連云港222023）

鉑類是大腸癌患者最常用的化療藥物，但在不同種族人群中、不同個體間仍有顯著的化療有效率／毒性反應，目前應用的抗腫瘤藥物對至少70%的患者療效有限，20%－40%的患者甚至有可能接受了錯誤的藥物治療［1］，因此對腫瘤藥物的療效預測成為腫瘤治療領域的研究熱點。乳腺癌易感基因家族（breast cancer susceptibility gene BRCA）通過基因表達調控、細胞周期調節、DNA重組修復等發揮腫瘤抑制功能及參與DNA修復，其功能失活與散發性乳腺癌、卵巢癌發生有關。近來的研究顯示BRCA－1與紫杉類及鉑類藥物療效相關，是提示預后及化療療效的預測分子［2，3］。錯配切除修復蛋白（excision repair cross complement1ERCC1）是DNA修復途徑中最主要的基因之一［4］，目前研究表明其mRNA或蛋白低表達與鉑類為基礎的非小細胞肺癌化療的總生存時間延長存在明顯的相關性［5］。因此，我們采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT－qPCR）檢測大腸癌患者的石蠟包埋組織中 BRCA－1mRNA、ERCC－mRNA 表達，研究其與臨床病理特征及與預后的關系，為大腸癌患者個體化治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2005年07月至2010年10月手術切除并經病理證實、資料完整的大腸癌患者54例，其中，男34例，女20例，中位年齡65歲（44－78歲）。臨床分期按第七版AJCC腫瘤分期標準，其中臨床Ⅰ、Ⅱ期30例，Ⅲ期8例，Ⅳ期16例；無淋巴結轉移28例，有淋巴結轉移26例，所有患者均在我院接受化療并有完整的隨訪資料，隨訪時間至2012年10月，化療方案采用以奧沙利鉑為基礎的方案（表1）。

1.2 治療方法 mFOLFOX方案：奧沙利鉑85 mg／m2第1天，亞葉酸鈣400mg／m2第1天，5－氟尿嘧啶400mg／m2靜推第1天，繼5－氟尿嘧啶2 000mg／m2CIV46小時，雙周方案，共六周期。

1.3 臨床觀察及評價 主要觀察指標總生存時間（overall survival，OS），次要觀察指標至腫瘤進展時間（Time－To－Progression TTP）。總生存時間為從確診之日起（手術日）至末次隨訪或死亡（死于原發腫瘤或并發癥）的時間。至腫瘤進展時間為從首次化療到病人出現腫瘤進展的時間。

1.4 主要試劑及儀器

實時熒光定量PCR儀（7900HT Fast）購自美國ABI公司 ；核酸蛋白檢測儀（Eppendorf Biophotometer plus）購自德國艾本德公司；石蠟RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購自德國Qiagen公司；熒光染料購自美國AB公司；引物由上海生工公司合成。

1.5 實驗方法

1.5.1 SYBR Green RT－qPCR 檢 測 BRCA－1mRNA表達按照試劑盒說明提取石蠟RNA（RNase－free FFRE Kit，Qiagen），進行逆轉錄合成cDNA，RT反應體系10μl：gDNA：1μl，2μl RNA和4μl DEPC－H2O 42℃ 2min，然后加入0.5μl Primer（10nmol／μl），0.5μl RT 酶，Buffer：2μl，42℃30min，95℃5min。上機進行檢測，定量PCR反應體系：Master Mix：2.5μl，模板cDNA 1 μl，上下游引物各0.25μl（20pmol／μl），H2O 1μl，（5μl體系）。反應條件：94 ℃30s，60 ℃1min，68℃2min，40個循環，最后68℃7min。利用軟件分析其Ct值，與其對應的Beta－actin基因的量進行校正，CUT OFF值取實驗室質控的標準值BRCA－1 6.5，ERCC4.8，小于CUT OFF值定義為低表達，大于等于CUT OFF值定義為高表達。

1.5.2 引物的設計和合成 根據GeneBank報道的人ERCC－1，BRCA－1基因cDNA設計引物如下：

1.6 統計學處理

應用統計軟件SPSS17.0進行數據分析，組間比較采用t檢驗，采用COX回歸法進行多因素分析，生存分析采用Kaplan－Meier法，生存率的比較采用Log－rank法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BRCA－1mRNA結果 所有大腸癌組織中均有BRCA－l mRNA 表達，其 RT－qPCR 體系無非特異性擴增，反應穩定，重復性好。54例大腸癌患者中，BRCA－1mRNA低表達20例（37.04%），高表達34例（62.97%）。BRCA－1mRNA 表達水平與臨床分期、淋巴結轉移有統計學意義（P＝0.034；P＝0.037）。

2.2 BRCA－1mRNA表達水平與54例患者總生存時間的關系 BRCA－1低表達水平組：中位生存時間 MST（47.84月）；BRCA－1高表達水平組：中位生存時間 MST（35.36月），二者無統計學差異（P＝0.137）（表2，圖1）。

2.3 BRCA－1mRNA表達水平與16例晚期大腸癌患者總生存時間及至腫瘤進展時間的關系 總生存時間：BRCA－1mRNA 高表達患者（32.6月）長于低表達患者（9.5月，P＝0.026）；至腫瘤進展時間：BRCAmRNA高表達患者（10.3月）長于低表達患者（4.3月，P＝0.026）（表3）。

2.4 ERCCmRNA結果 所有大腸癌組織中均有ERCCmRNA表達，其RT－qPCR體系無非特異性擴增，反應穩定，重復性好。54例大腸癌患者中，ERCCmRNA低表達14例（25.93%），高表達40例（74.07%）。ERCC1mRNA表達水平與臨床分期、淋巴結轉移等惡性生物學行為無關（P＞0.05）。

2.5 ERCCmRNA表達水平與54例患者總生存時間的關系 ERCC低表達水平組：中位生存時間MST（49.50月）高于低表達患者（30.33月，P＝0.014）。

2.6 ERCCmRNA表達水平與16例晚期大腸癌患者總生存時間及至腫瘤進展時間的關系 總生存時間：ERCCmRNA低表達患者（41.1月）長于高表達患者（20.7月，P＝0.018）；患者至腫瘤進展時間：ERCCmRNA高表達患者（9.5月）長于低表達患者（8.9月，P＝0.966）。

2.7 ERCC 與 BRCA－1表達具有正相關性（r＝0.497 P＜0.05）。

3 討論

鉑類藥物是治療大腸癌的有效藥物之一，但不同患者對治療的敏感性存在顯著差異，預后也不同。其作用機制主要通過和細胞DNA雙鏈耦合形成加合物或形成鏈間交叉連接而損傷DNA，進而誘導凋亡，殺滅腫瘤細胞。DNA修復能力是影響鉑類藥物療效的重要原因，ERCC1－1是核苷酸切除修復（nucleotide excision repair，NER）途徑的限速酶，在NER途徑中起著DNA損傷識別和鏈間切割的關鍵作用，它的表達降低一方面預示腫瘤細胞基因組不穩定性增加，腫瘤細胞惡性程度高，易出現早期轉移［6］，但我們的研究顯示ERCC－1的表達與大腸癌分期、分化、淋巴結轉移數目等惡性生物學行為無關（P＞0.05），提示ERCC－1盡管參與了腫瘤的惡性生物學行為，但由于大腸癌發生發展的不同階段是多基因參與、多因素共同作用的結果，因此并未對腫瘤細胞的惡性表型起決定性作用。另一方面ERCC－1表達降低提示腫瘤細胞對DNA靶向性藥物的修復能力降低，進而增加藥物敏感程度，更易從此類藥物治療中獲益［7］。研究表明ERCC－1高表達能使順鉑誘導DNA結合物的清除率增加，從而降低順鉑的療效以及肺癌患者的生存時間。ERCC1表達與肺癌含鉑方案化療生存時間的關系經國際多中心研究證實有肯定價值［8］：只有ERCC1低表達者可從化療中獲益，高表達不會獲得臨床療效，卻增加藥物毒副作用。Shirota Y［9］研究50例大腸癌腫瘤組織ERCC1，ERCC1低于臨界值，其 MST為10.2月，高于臨界值，其MST為1.9月，我們的研究也提示ERCC－1低表達患者在接受以鉑類為基礎的化療后，晚期患者的總生存時間及所有期別患者的總生存期均長于高表達患者，提示ERCC－1不但是鉑類藥物的分子預測指標，其低表達不管在早期還是晚期患者中均為預后良好的預測因素，多因素分析亦顯示ERCCmRNA低表達可以作為大腸癌患者預后良好的獨立預測因素，這與國外研究結論基本一致。

表1 54例大腸癌患者的臨床資料

表2 BRCA－1、ERCCmRNA表達與大腸癌患者OS的關系

表3 BRCA－1、ERCCmRNA表達與16例晚期大腸癌患者OS、TTP的關系

圖 A the OS of BRCA－1low－expression and high－expression（1.00 low－expression；2.00high－expression）圖B the OS of ERCC low－expression and high－expression（1.00lowexpression；2.00high－expression）

BRCA－1的重要功能是G2－M檢測點的調節，BRCA在有絲分裂期間聯合定位于中心體，控制有絲分裂紡錘體的組裝及子代細胞特有的染色體分離，從而影響細胞的分化。相關的研究表明，BRCA－1高表達預示著腫瘤惡性程度高，侵襲性強，預后差，在乳腺癌及肺癌中已有報道［10，11］，但我們的研究提示BRCA－1mRNA的表達與腫瘤分期、及淋巴結轉移的惡性生物學行為有顯著相關性（P＜0.05），但與腫瘤的分化程度及病理類型無關，說明BRCA可能通過基因調控多途徑參與腫瘤的侵襲轉移，但不參與腫瘤分化過程的調節。同時BRCA直接參與DNA的修復，BRCA－1編碼對DNA損害起反應的蛋白，這些蛋白產物與Rad51及其它已知參與DNA修復的蛋白之間均有作用，BRCA的功能失活導致DNA斷裂的修復功能降低，從而使患者對DNA交聯劑、誘導DNA雙鏈斷裂的藥物如鉑類敏感［7］。Rosell［12］等報道在接受以鉑類為基礎化療方案的非小細胞肺癌患者中，BRCA－1低表達的2年生存率高于BRCA－1高表達者，可見BRCA－1低表達患者能從鉑類藥物的治療中獲益。我們的結果顯示BRCA－1低表達患者在接受以鉑類為基礎的化療后，低表達患者總生存期長于高表達患者，但沒有統計學意義。我們的研究顯示在晚期大腸癌患者中，其高表達患者總生存時間及至疾病進展時間均長于低表達患者（P＜0.05），分析結果考慮與BRCA－1表達與患者分期有顯著相關性有關，在我們研究的16例晚期大腸癌患者中，有14例患者高表達，因此可能造成數據的偏倚性。因此也提示盡管其表達水平與ERCC表達存在正相關性，但BRCA可能在不同分期中有不同的預測意義，目前BRCA－1尚不能作為大腸癌患者鉑類藥物化療療效及預后的分子預測指標。

總之，我們采用實時熒光定量PCR技術聯合檢測大腸癌患者BRCA－1、ERCCmRNA表達水平，結果顯示ERCCmRNA表達水平可以作為預測大腸癌患者鉑類化療及預后的獨立預測指標，而BRCA－1mRNA盡管與ERCCmRNA表達有正相關性，但其表達在不同期別患者中存在相反的結果，因此目前尚沒有足夠證據作為大腸癌患者預后及鉑類化療的預測因素，需進一步擴大樣本研究。

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