原發(fā)性肝癌高遷移率族蛋白B1表達(dá)改變及其機(jī)制

王婷婷，韓菲菲，梁加貝，王發(fā)龍，陳國(guó)千＊

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科；2.病理科，江蘇 無(wú)錫214023）

高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）為主要存在于細(xì)胞核中的一種非組蛋白，參與核內(nèi)多種功能。許多種類細(xì)胞受誘導(dǎo)因素誘導(dǎo)后可以胞外釋放HMGB1，胞外HMGB1參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移等有關(guān)［1］。近年研究［2］表明，HMGB1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，但原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）組織 HMGB1的表達(dá)改變及其血清HMGB1水平檢測(cè)和臨床意義研究報(bào)道甚少，肝癌細(xì)胞HMGB1釋放機(jī)制尚未見探討。本文就原發(fā)性肝癌HMGB1表達(dá)改變及其機(jī)制進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

48例健康對(duì)照者為本院體檢人群的健康者，38例慢性乙肝、32例乙肝后肝硬化和23例繼發(fā)性肝癌患者來(lái)自本院門診和住院部，年齡29－60歲；繼發(fā)性肝癌患者的原發(fā)癌有胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、膽囊癌、胰腺癌、子宮癌、卵巢癌等。39例PHC患者來(lái)自本院住院部，均為初次入院、未經(jīng)治療者，并經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)，年齡32－64歲，其中腫瘤大小＜2cm 14例、≥2cm 25例，TNM分期Ⅰ或Ⅱ期17例、Ⅲ或Ⅳ期22例。人肝癌細(xì)胞株SMMC－7721購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。DMEM高糖培養(yǎng)液為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 HMGB1mRNA表達(dá)量檢測(cè)

按Trizol試劑說(shuō)明書提取肝組織或肝細(xì)胞中總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，cDNA產(chǎn)物置－20℃保存。使用ABI－7500熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR參數(shù)為95℃預(yù)變性30sec、95℃變性5sec、60℃退火延伸34sec，循環(huán)40次。HMGB1引物：F 5’－GATCCCAATGCACCCAAGAG－3’，R 5’－TCGCAACATCACCAATGGAC－3’；GAPDH 引物：F 5’－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3’，R 5 ’－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－3 ’。 以HMGB1和 GAPDH 的 Ct值之差（△Ct）作為HMGB1mRNA相對(duì)表達(dá)水平的指標(biāo)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

SMMC－7721細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液在CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)（37℃，5%CO2、95%空氣），細(xì)胞貼壁覆蓋達(dá)80%－90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。缺氧組置于YCP－50S三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5%CO2、1%O2、94%N2），常氧組進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)8次。

1.4 培養(yǎng)上清液HMGB1含量測(cè)定

血清或培養(yǎng)上清液中HMGB1含量使用HMGB1ELISA試劑盒（Shino－Test公司）檢測(cè)，按產(chǎn)品使用說(shuō)明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包，兩組間均數(shù)比較采用雙側(cè)Satterthwaite近似法t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩指標(biāo)變量關(guān)系采用Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHC患者血清HMGB1水平的改變

健康對(duì)照、慢性乙肝、乙肝后肝硬化、繼發(fā)性肝癌和PHC各組的血清HMGB1水平分別為3.9±1.4、4.6±1.8、6.3±2.8、17.2±6.7和 13.5±6.3 μg／L，肝病各組血清HMGB1水平升高，尤以繼發(fā)性肝癌組和PHC組升高顯著，且繼發(fā)性肝癌組高于PHC 組 （P＜0.05），見 圖 1。PHC 組 血 清HMGB1水平與血清甲胎蛋白水平之間具有正相關(guān)性（r＝0.614，P＜0.01）。PHC組TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期患者血清 HMGB1水平（16.4±6.4μg／L）明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者（9.7±4.0μg／L）（P＜0.01）。

圖1 肝病患者血清HMGB1水平

2.2 PHC組織中HMGB1基因表達(dá)的改變

通過(guò)RT－PCR檢測(cè)，11例PHC（TNM 分期為Ⅲ、Ⅳ期）組織中 HMGB1mRNA相對(duì)表達(dá)水平（△Ct）（2.91±0.56）較癌旁組織（4.73±0.95）明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。

2.3 缺氧對(duì)肝癌細(xì)胞HMGB1基因表達(dá)和胞外釋放的影響

SMMC－7721細(xì)胞經(jīng)缺氧培養(yǎng)6h后，HMGB1 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01），并隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，見圖2；而在常氧培養(yǎng)24h內(nèi)，HMGB1mRNA表達(dá)無(wú)顯著性改變。經(jīng)缺氧培養(yǎng)3h后，培養(yǎng)上清液中HMGB1含量即見時(shí)間依賴性升高，見表1。

圖2 缺氧對(duì)肝癌細(xì)胞HMGB1mRNA表達(dá)的影響

表1 缺氧對(duì)肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1含量的影響（μg／L，±s）

表1 缺氧對(duì)肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1含量的影響（μg／L，±s）

注：／未檢出；與常氧組比較，＊P＜0.01

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3 討論

PHC是最常見的惡性腫瘤之一，尤其在中國(guó)，病例數(shù)占全球的半數(shù)以上。近十多年來(lái)，雖然PHC的早期診斷技術(shù)和治療手段有了明顯的提高和改善，但PHC患者的預(yù)后仍然較差［3］。PHC的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，其分子機(jī)制有待深入研究。HMGB1為一種主要位于細(xì)胞核內(nèi)與DNA非特異性結(jié)合、進(jìn)化高度保守的非組蛋白，分子量約30kDa，參與核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、DNA重組和修復(fù)、核小體構(gòu)建和穩(wěn)定以及類固醇激素調(diào)控等，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中快速遷移而得名［1］。諸多研究［1］表明，許多種類細(xì)胞如免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等受胞外誘導(dǎo)因素（如脂多糖、干擾素－γ、生物活性脂、缺氧等）誘導(dǎo)后可主動(dòng)分泌HMGB1，分泌后的胞外HMGB1參與介導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移等。

近年研究［2］顯示，發(fā)生惡性腫瘤時(shí)，由于腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)和腫瘤組織微環(huán)境的改變，腫瘤組織細(xì)胞HMGB1通常表達(dá)增強(qiáng)和釋放增多，HMGB1與腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等有著密切關(guān)系。Dong等［4］報(bào)道，PHC組織中的 HMGB1基因和蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，其表達(dá)水平與腫瘤病理學(xué)分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)；利用shRNA敲除人肝癌細(xì)胞株HMGB1基因后，基質(zhì)金屬蛋白酶－2表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖活性和遷移能力下降。Yan等［5］研究結(jié)果顯示，PHC組織和細(xì)胞HMGB1高表達(dá)，HMGB1通過(guò)TLR4和RAGE信號(hào)通路誘導(dǎo)半胱氨酸蛋白酶－1（caspase－1）活化，后者介導(dǎo)若干炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，并促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，PHC（TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期）組織中的HMGB1基因表達(dá)顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，與以上學(xué)者的研究結(jié)果一致。肝癌患者血清HMGB1水平的變化及其意義研究較少，Cheng等［5］報(bào)道，PHC患者血清HMGB1水平（84.2±50.4ng／ml）高于健康者（7.0±5.9ng／ml），本研究結(jié)果顯示，PHC患者血清HMGB1水平（13.5±6.3ng／ml）明顯升高，并與其TNM分期有關(guān)，但結(jié)果值明顯低于Cheng的報(bào)道結(jié)果，可能與前者采用蛋白印跡法檢測(cè)有關(guān)。結(jié)果也顯示，繼發(fā)性肝癌患者血清HMGB1水平顯著升高，可能與繼發(fā)性肝癌患者為晚期癌癥并存在多處腫瘤有關(guān)，并提示其它腫瘤組織細(xì)胞HMGB1表達(dá)或釋放增多。

腫瘤組織HMGB1表達(dá)增強(qiáng)的分子機(jī)制迄今未見研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺氧狀態(tài)對(duì)肝癌細(xì)胞HMGB1基因表達(dá)和胞外釋放有明顯影響。腫瘤組織因細(xì)胞增殖過(guò)快、血管分布紊亂和結(jié)構(gòu)異常而常處于缺氧微壞境中，我們前期研究［7，8］結(jié)果也顯示，缺氧可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞等HMGB1基因表達(dá)和胞外釋放，提示腫瘤組織HMGB1表達(dá)增強(qiáng)與其發(fā)生的缺氧微壞境有關(guān)。

血清HMGB1作為潛在的肝癌標(biāo)志物值得關(guān)注和進(jìn)一步研究。

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