絞股藍總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

居立娟，王云東

（1.吉林市兒童醫院 兒內科，吉林 吉林132001；2.北華大學第二臨床醫院·吉化總醫院 眼科）

絞股藍別名七葉膽、小芍藥云、羅鍋底、遍地生根等。其味苦、性寒，具有清熱解毒、祛痰止咳之功效。絞股藍的主要成分為絞股藍總皂苷（Gypenosides，GP）。近年來，人們對GP進行了大量研究，發現其有廣泛的藥理作用，其中對心腦血管的研究引起了學者的廣泛關注。研究發現，GP能夠保護心臟的缺氧性損傷，改善心肌缺血時心臟的舒張功能［1］，在一定程度上還能減輕甚至阻止心肌缺血所致心肌壞死，減少自由基的生成和鈣離子內流［2－3］。GP能夠舒張血管，降低血壓，抑制血小板聚集，對氧自由基引起的腦血管痙攣具保護作用［4－6］。雖然絞股藍總皂苷對腦缺血損傷具有一定的保護作用，但是其作用機制方面的研究資料報道較少。

本文通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，研究絞股藍總皂苷對腦缺氧性損傷的保護作用并探討其機制，為腦缺血的預防提供新的思路，同時也為開發抗腦缺血新藥提供有價值的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與動物

絞股藍總皂苷購于西安鴻生生物技術有限公司；H2O2購于北京鼎國生物技術發展中心；SOD、MDA檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；Bcl－2、Bax大鼠多克隆抗體購于美國Santa Crnz公司；DAB檢測試劑盒購于福州邁新生物技術開發公司。

1.2 動物分組及給藥

60只雄性Wistar大鼠，體重200－250g，按體重隨機分為6組，每組10只，即假手術組、模型組、血塞通陽性藥組（20mg·kg－1）、絞股藍總皂苷高、中、低劑量組（100、30和10mg·kg－1）。每天腹腔注射（ip）給藥1次（前兩組為相同體積的生理鹽水），連續給藥7天。

1.3 大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立

末次給藥30min后，模型組、陽性藥組及受試藥各劑量組用20%水合氯醛麻醉，分離右側頸總動脈和頸內、頸外動脈，頸總動脈剪口后將一段一端加熱變鈍的3.5號魚線插入頸內動脈并推入至前腦動脈約18mm（自頸內外動脈分叉處算起），用縫合線結扎固定尼龍線，縫合皮膚。術后2h出現豎毛，右眼horner＇s征，左側偏癱的大鼠為陽性，2h后進行缺血再灌注。假手術組只對頸內和頸外動脈進行分離，不結扎。

1.4 大鼠神經功能評分的測定

大鼠腦缺血再灌注22h后進行行為神經功能評分，標準為：活動正常者為0分；豎毛，輕度運動低下者為0.5分；前肢屈曲運動障礙者為1.0分；行動不協調，屈曲姿勢，轉圈運動者為2.0分；偏癱，不能行走者為3.0分；昏迷者為4.0分；死亡者為5.0分（術后2h以上死亡者）；運動障礙越明顯者得分越高。

1.5 腦組織勻漿中SOD、MDA及NO含量測定

實驗結束后，將大鼠立即斷頭取腦取血。取大約0.1g的腦組織制成均漿。SOD、MDA、NO的檢測按照試劑盒說明書操作，分別在550nm、532nm和340nm處，用6010紫外分光光度計檢測。

1.6 腦梗死范圍的測定

實驗結束后，將大鼠立即斷頭取腦，將腦組織進行冠狀切片，間隔4mm共5片，放入2%TTC磷酸鹽緩沖液（pH7.4）37℃水浴10min，缺血缺氧壞死的神經細胞因細胞膜損傷而導致脫氫酶缺失所以不染色，呈現白色，而非壞死的神經細胞呈現鮮紅色。腦組織拍片后，應用BI2000軟件計算，以白色區面積之和與腦組織總面積的百分比來計算腦梗死范圍。

1.7 HE染色

實驗結束后，將大鼠立即斷頭取腦，腦組織常規固定，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于光學顯微鏡（200×）下觀察，選取大腦中動脈供血區不重疊的3個視野攝片。

1.8 免疫組化染色檢測Bcl－2、Bax蛋白的表達

腦組織切片脫蠟和水化后，置于濕盒內，滴加50μl過氧化物酶阻斷液（試劑A），室溫孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3 min×2，滴加50μl非免疫動物血清（試劑B）室溫孵育10min，PBS沖洗3min×2，去除血清，滴加50 μl一抗（兔抗大鼠Bcl－2、Bax多克隆抗體，1：100稀釋）4℃過夜，PBS沖洗3min×3，滴加50μl辣根過氧化物酶標記的二抗（羊抗兔多克隆抗體，試劑C）室溫孵育10min，PBS沖洗3min×2，滴加50μl DAB，顯微鏡下觀察3－10min，自來水沖洗，蘇木素復染，氨水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察細胞漿中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，每個標本在高倍鏡下（400×）觀察不重疊的2個視野，采用HPIAS－1000型圖像分析儀計數陽性細胞數，取平均值。

1.9 結果處理和統計

所有數據均以平均值±標準差（x±SD）表示，應用SPSS11.5版統計學軟件進行處理。各組間比較采用單因素方差分析，成組數據比較采用t檢驗，百分數的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 絞股藍總皂苷對大鼠神經功能評分的影響

結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分明顯升高（P＜0.01），說明模型成立；與模型組比較，絞股藍總皂苷100mg·kg－1、30mg·kg－1劑量組大鼠神經功能評分明顯降低（P＜0.05）與陽性對照藥血塞通組作用相近；而絞股藍總皂苷10 mg·kg－1劑量組大鼠神經功能評分與模型組比較差異無顯著性（P＞0.05）。結果見表1。

表1 絞股藍總皂苷對大鼠神經功能評分的影響

2.2 絞股藍總皂苷對大鼠腦組織中SOD及MDA、NO含量的影響

與模型組比較，絞股藍總皂苷100和30mg·kg－1劑量組大鼠腦組織中SOD活性明顯增強，MDA含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01﹚；絞股藍總皂苷10mg·kg－1劑量組SOD活性，MDA含量也分別有增強及下降趨勢，但差異無顯著性﹙P＞0.05﹚；絞股藍總皂苷各劑量組大鼠腦組織中NO含量均有下降趨勢，但無統計學意義（P＞0.05），結果見圖1。

圖1 絞股藍總皂苷對大鼠腦組織中SOD，MDA和NO含量的影響

2.3 絞股藍總皂苷對大鼠腦梗死面積的影響

模型組大鼠的腦梗死范圍為（43.18±3.52）%明顯高于假手術組（P＜0.001）；而絞股藍總皂苷100和30mg·kg－1劑量組大鼠的腦梗死范圍分別為（30.57±4.15）%、（35.84±3.84）%均明顯低于模型組（P＜0.05），其中100mg·kg－1劑量組大鼠的腦梗死范圍與陽性對照藥血塞通組相近；絞股藍總皂苷10mg·kg－1劑量組大鼠的腦梗死范圍與模型組比較差異無顯著性（P＞0.05），結果見表2。

表2 絞股藍總皂苷對大鼠腦梗死面積的影響（n＝10，±s）

表2 絞股藍總皂苷對大鼠腦梗死面積的影響（n＝10，±s）

與模型組比較＊＊P＜0.01，＊P＜0.05；與假手術組比較＋＋P＜0.001

?

2.4 HE染色結果

光鏡下假手術組大鼠腦皮質神經元胞體呈圓形，胞核規整，染色質分布均勻，胞膜完整，胞質無明顯嗜伊紅染色；模型組變性壞死的神經元主要分布在大腦皮層，缺血壞死區腦組織水腫、疏松，可見大量神經元胞體為三角形，核固縮，核溶解，核仁消失，胞質嗜伊紅染色，細胞周圍間隙增寬，水腫空泡形成，神經元間隙擴大；絞股藍總皂苷100mg·kg－1劑量組可見腦皮質局限性壞死灶，區域內腦組織結構水腫，疏松，可見少量神經元胞體呈三角形，胞質嗜伊紅染色；陽性對照藥血塞通組病理改變與絞股藍總皂苷高劑量組相近；絞股藍總30mg·kg－1劑量組較多神經元胞體呈三角形，胞質嗜伊紅染色；絞股藍總皂苷10mg·kg－1劑量組腦皮質區可見局限性壞死灶，神經元胞體呈三角形，胞質嗜伊紅染色，結果見圖2。

圖2 絞股藍總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織HE染色的影響 （200×）

2.5 免疫組化染色結果

結果顯示，光鏡下觀察細胞漿中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，結果見表3。

表3 用免疫組化方法檢測絞股藍總皂苷對Bcl－2和Bax蛋白表達的影響（n＝10，±s）

表3 用免疫組化方法檢測絞股藍總皂苷對Bcl－2和Bax蛋白表達的影響（n＝10，±s）

與模型組比較＊＊P＜0.001，＊P＜0.05；與假手術組比較＋＋P＜0.001

?

3 討論

大腦的正常功能活動依賴于血液的供應，當腦組織缺血時，會損傷神經細胞的功能，甚至造成不可逆的損傷。研究發現，腦組織在缺氧或缺血性損傷時能夠產生大量的氧自由基。神經細胞膜中蛋白質、脂質因自由基的影響而遭到破壞，引起脂質過氧化，線粒體功能喪失、溶酶體破裂、以及組織水腫等一系列損害作用。SOD具有清除超氧陰離子，保護細胞膜，抗氧化等作用［7］。MDA是脂質過氧化反應中的代謝產物，通過檢測 MDA含量可以預知機體中自由基的含量及自由基造成的損傷程度［8］。NO是一種新型自由基，腦缺血時大量產生將引起蛋白質、脂質以及DNA損傷的氧化應激，最終造成神經細胞死亡。

本實驗結果顯示，絞股藍總皂苷可使腦缺血再灌注大鼠的行為指標評分明顯降低，腦組織勻漿中SOD水平升高，MDA及NO的含量降低，減少腦梗死面積，形態學結果顯示，絞股藍總皂苷能夠減輕腦組織水腫，改善神經細胞損傷，使空泡減少，表明絞股藍總皂苷可減輕腦缺血再灌注所造成的損傷，改善腦功能。

Bcl－2蛋白及其家族成員通過一個非常復雜的網絡來調控細胞的凋亡。Bcl－2蛋白家族分為2類：一類是抗凋亡的蛋白，包括Bcl－2、Bcl－w、Bcl－xL；另一類是促進凋亡的蛋白，主要有Bax、Bad、Bak。Bcl－2蛋白可作為氧化劑調節細胞的氧化還原狀態，通過減少氧自由基的產生，減少Ca2＋的釋放，維持Ca2＋的穩定而對抗細胞的凋亡。Bax蛋白在受到凋亡信號刺激時其構象會發生變化，導致細胞色素C釋放，從而引起凋亡，所以Bcl－2／Bax比值高，細胞存活率高，比值低，細胞凋亡率高［9－10］。

本實驗結果顯示，假手術組可見Bcl－2表達的陽性細胞和少量的Bax表達的陽性細胞；模型組Bcl－2蛋白表達強度顯著低于假手術組，Bax蛋白表達強度顯著高于假手術組。而絞股藍總皂苷各組Bcl－2蛋白表達明顯高于模型組，Bax蛋白表達明顯低于模型組，因而Bcl－2／Bax二者比例提高，說明絞股藍總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用是通過在轉錄及翻譯水平調節Bcl－2和Bax的表達實現。本實驗結果將為臨床腦缺血患者的治療方面提供新思路，并為今后絞股藍總皂苷應用于臨床提供實驗依據。

［1］陳劍雄，等.絞股藍總皂甙對氧自由基所致腦血管痙攣的保護作用［J］.中草藥1997，24（4）：219.

［2］Satoh I，Sakai N，Enokido Y，Uchiyama Y.Free radical independent protection by nerve growth factor and Bcl－2of PC12cells from hydrogenperoxidetriggered－apoptosis［J］.Journal of Biochemistry，2002，20（4）：320.

［3］Chen J，Zhu RL，Nakayama M.Expression of the apoptosis－effector gene，Bax，is upregulated in vulnerabl hippocampal CA1 neurons following global ischemia［J］.J Neuron chem，1998，67（6）：64.

［4］Fjimura M，Morita－Fujimura Y，Noshita N，et al.The cytosolic antioxidant copper／zinc－superoxide dismutase prevents the early release of mitochondrial cytochrome c in ischemic brain after transient focal cerebral ischemia in mice［J］.J Neurosci，2000，20（8）：2817.

［5］Loucks EB，Godin DV，Wallet＇KR，et al.Role of platelet activating factor in cardiac dysfunction，apoptosis and nitric oxide synthase mRNA expression in the ischemic－reperfused rabbit heart［J］.Can－J－Cardiol，2003，19（3）：267.

［6］Fliss H，Gattinger D.Apoptosis in ischemic and reperfused rat myocardium ［J］.Circ Res，1996，79（5）：949.

［7］Kristain T，Siesjo BK.Calcium－related damage in ischemia［J］.Life Sci，1996，59（5）：357.

［8］章軍建，阮旭中，張蘇明.大鼠局灶性腦缺血再灌注半暗帶神經細胞壞死與凋亡的動態變化［J］.中華老年醫學雜志，1999，18：168.

［9］Qi J，Hong ZY，Xin H，Zhu YZ，et al.Neuroprotective effects of leonurine on ischemia／reperfusion－induced mitochondrial dysfunctions in rat cerebral cortex［J］.Biol Pharm Bull.2010；33（12）：1958.

［10］Chen J，Huang RB.Protective effect of Yulangsan polysaccharide on focal cerebral ischemia／reperfusion injury in rats and its underlying mechanism［J］.Neurosciences（Riyadh）.2009；14（4）：343.