不同破壁方法提取結核分枝桿菌總RNA的比較

羅影殊 高文鳳 黃偌穎 劉衡川

不同破壁方法提取結核分枝桿菌總RNA的比較

羅影殊 高文鳳 黃偌穎 劉衡川

目的建立簡便有效的結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）總RNA提取方法>。方法采用5種方法，分別為160、240和400W超聲波聯合Trizol法（簡稱“160W超聲法”、“240W超聲法”和“400W超聲法”）、玻璃珠（簡稱“玻珠”）聯合Trizol法（簡稱“玻珠法”）和Trizol法（簡稱“不加玻珠法”），對結核分枝桿菌標準株H37Rv進行破壁，提取總RNA。通過熒光定量逆轉錄PCR評價不同破壁方法對Mtb總RNA提取效果的影響，以滅菌超純水代替模板為陰性對照。每種方法分別提取3份樣本進行檢測。最后結果為3份標本的平均值>。結果玻珠法檢測組Ct值為20.67，△Rn值為0.644；400W 超聲法檢測組Ct值為22.09，△Rn值為0.571；240W超聲法檢測組Ct值為21.86，△Rn值為0.503；160W超聲法檢測組Ct值為25.21，△Rn值為0.411；不加玻珠法檢測組Ct值為28.40，△Rn值為0.299；陰性對照Ct值為40.00，△Rn值為0.000>。結論直觀地從試驗結果來看，玻珠法對結核分枝桿菌破壁效果好于超聲法。

分枝桿菌，結核； RNA，細菌； 逆轉錄聚合酶鏈反應； 細胞壁； 細菌學技術

20世紀80年代以來，結核病再次在全球肆虐，成為嚴重威脅人類健康的公共衛生問題。我國的結核病疫情形勢十分嚴峻，每年新登記的結核病患者約130萬，因結核病死亡者每年達13萬例。回顧性調查結果顯示我國結核病的誤診率可達24.1%［1］，提高實驗室檢測能力，促進早診斷、早治療是有效控制結核病蔓延的必要措施。目前，我國通過抗酸染色和細菌培養等方法發現肺結核患者并監測療效。傳統檢測方法不利于快速準確地診斷肺結核以及療效的評價，急需開發快速準確的檢測方法。

隨著基因組學和蛋白質組學的發展，相關技術也逐漸應用于結核快速診斷，如免疫學方法、PCR、核酸雜交等。PCR尤其是熒光定量PCR已作為結核病診斷的輔助實驗，其中對DNA的研究頗多［2－3］。但DNA較穩定，檢測存在平臺效應。研究表明，在抗酸染色和痰培養轉陰后仍能檢測到痰液中的DNA［4－5］。因此，DNA 不能用于結核分枝桿菌的活菌檢測。原核生物的mRNA不穩定，易降解，半衰期僅為數分鐘。因此，mRNA可作為活菌檢測的標志物。國內外已有基于mRNA的RT-PCR檢測活菌的成功報道［6－8］。

總RNA的提取是mRNA檢測最為關鍵的步驟，所得RNA的純度和完整性對實驗結果有較大的影響。結核分枝桿菌細胞壁特殊，難以像其他細菌通過去污劑或裂解劑裂解，需在常規RNA提取方法的基礎上輔以超聲波或加玻璃珠（簡稱“玻珠”）等機械破碎手段。

本課題在異硫氰酸胍－酚－氯仿抽提法（Trizol法）的基礎上，比較玻珠和不同功率的超聲波對結核分枝桿菌的破壁效果，以建立高效的結核分枝桿菌總RNA提取方法。

材料和方法

一、材料

1.實驗菌株：結核分枝桿菌標準株H37Rv，來自成都市結核病防治研究院。

2.主要試劑和儀器：直徑0.5mm玻珠（美國Sigma公司）；RNAiso Plus、Taq聚合酶［寶生物工程（大連）有限公司］；PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］；中性羅氏培養基（博慧斯生物醫藥科技有限公司）；超聲儀（成都肯格王三氧電器設備有限公司）和熒光定量PCR儀（上海宏石醫療科技有限公司）。

3.引 物 序 列：上 游 引 物：5′-GACAGACGTGAGCCGAAAGAT-3′；下 游 引 物：5′-GGAAGGACTACAGCCGCTG-3′；分子信標探針：5′-FAMCTTGGGGACGCCGATTGATGATCCAAGDABCYL-3′。由寶生物工程（大連）有限公司合成。

二、方法

（一）細菌培養

用滅菌的接種環輕輕刮取H37Rv菌落，接種于改良羅氏培養基，37℃培養20～25d。

（二）結核分枝桿菌總RNA提取方法

取5支1.5ml eppendorf（EP）管，各稱取0.2g H37Rv菌體，分別標記為160W超聲法組、240W超聲法組、400W超聲法組、玻珠法組和不加玻珠法組。各組分別加入1ml Trizol試劑，漩渦振蕩混勻。處理如下：160W超聲法組、240W超聲法組和400W超聲法組－70℃ 放置10min，沸水速融，分別經過160W、240W和400W超聲波處理3次，每次3min，間歇10s。玻珠法組加玻珠（0.2g）；不加玻珠法組不做處理；玻珠法和不加玻珠法組漩渦振蕩器振蕩1min。5個實驗組分別加入200μl氯仿，振蕩30s，室溫放置10min。4℃，12 000×g離心15min，樣品分為3層，上層（無色水相）、中間層和粉紅色有機層；取500μl上層無色水相于新的EP管中，加入300μl糖原（1000μmol／ml）和500μl異丙醇，室溫10min。4℃，10 000×g離心10min；棄上清，加600μl 75%乙醇，搖勻。4℃，7000×g離心5min。棄去上清，室溫盡量干燥，加入30μl DEPC（diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）水溶解沉淀，保存于－70℃冰箱。如樣本為痰液，則需先進行液化再提取RNA。具體步驟為：加2～4倍痰液體積的4%NaOH，漩渦振蕩器混勻，室溫放置20min，12 000×g離心10min，棄上清。加500ml無菌水，漩渦振蕩器混勻，12 000×g離心5min，棄上清。重復上次操作。5種方法分別提取3份樣本的總RNA。

（三）RNA逆轉錄生成cDNA

1.總RNA基因組中殘留DNA的去除：為防止總RNA提取液中DNA造成結果假陽性，通過gDNA Eraser去除上述5種方法提取的總RNA標本中的DNA。體系為5×gDNA Eraser Buffer 2μl，gDNA Eraser 1μl，滅菌超純水2μl，總RNA模板5μl，總體積10μl。42℃孵育2min（PCR儀中進行）。產物－70℃保存。

2.RNA逆轉錄：將上述去除DNA的RNA提取液作為模板，進行逆轉錄過程（表1）。體系為去除DNA的RNA10μl，滅菌超純水4μl，5×Prime-Script?Buffer 4μl，Reverse Transcription Primer Mix（逆轉錄引物混合物）1μl，PrimeScript?RT Enzyme Mix 1μl，總體積20μl。37℃孵育15min，85℃5s（PCR儀中進行）。產物可用于熒光定量PCR檢測，－20℃保存。

3.總RNA中混有基因組DNA的去除效果的測定：上述5種方法提取的總RNA均按表1進行實驗分組，驗證DNA去除效果。陰性對照以滅菌超純水代替模板。

表1 RNA提取液中DNA去除效果驗證試驗

4.熒光定量 PCR 檢測［9］cDNA：RNA 提取液中DNA去除效果驗證試驗、模擬痰樣本的熒光定量PCR檢測步驟均按以下操作進行。分子信標熒光定量PCR檢測結核分枝桿菌的反應的體系：滅菌超純水 8.65μl，10×Buffer 2.5μl，MgCl26μl，dNTP 1μl，上下游引物各0.5μl，分子信標探針0.25μl，Taq DNA聚合酶0.6μl，模板5μl，總體積為25μl。陰性對照以滅菌超純水代替模板。

反應循環條件為：94℃3min，94℃20s，61℃20s，72℃20s，40個循環。反應結束后，以熒光定量PCR分析軟件設定基線和閾值（0.05），得到以循環數（Ct值）為橫坐標、熒光值（△Rn值）為縱坐標的定量擴增曲線。Ct值≤38為陽性，＞38為陰性。

5.模擬痰樣的制作及檢測：稱取0.2g新鮮培養的結核分枝桿菌H37Rv菌體2份，一份加入一定量的正常人痰液中，另一份不做處理。兩份樣本均按玻珠法提取RNA，gDNA Eraser去除DNA，逆轉錄得到cDNA，通過熒光定量PCR檢測，評價所用總RNA提取方法對模擬痰液中結核分枝桿菌的提取效率。陽性對照為水煮得到的結核分枝桿菌H37Rv DNA，陰性對照以滅菌超純水代替模板。

結 果

一、總RNA中混有基因組DNA的去除效果

圖1為玻珠法組實驗結果。設定閾值為0.05，可見逆轉錄產物組有明顯躍遷，去DNA產物組無躍遷，說明gDNA Eraser可去除RNA提取物中的DNA，且不會影響RNA的檢出。其余4種方法結果與玻珠法組相同。因此，gDNA Eraser是有效的基因組去除劑。

圖1 玻珠組熒光定量逆轉錄PCR檢測gDNA Eraser去除DNA效果的擴增曲線圖

二、5種RNA提取方法提取效率的比較

設定閾值為0.05，玻珠法檢測組Ct值為20.67（20.83、20.12、21.06），△Rn 值為 0.644（0.653、0.612、0.667）；400W 超聲法檢測組 Ct值為22.09（22.23、21.85、22.19），△Rn 值為 0.571（0.573、0.557、0.584）；240W 超聲法檢測組 Ct值為21.86（21.78、21.26、22.54），△Rn 值為 0.503（0.500、0.516、0.493）；160W 超聲法檢測組 Ct值為25.21（25.34、25.40、24.89），△Rn 值為 0.411（0.403、0.400、0.431）；不加玻珠法檢測組 Ct值為28.40（28.22、28.02、28.96），△Rn 值為 0.299（0.299、0.313、0.284）；陰性對照Ct值為40.00，△Rn值為0.000。玻珠法檢測組Ct值最小，表明在5種RNA提取方法中，加玻珠破壁提取結核分枝桿菌總RNA效果最好。圖2為其中的1次結果。

圖2 5種結核分枝桿菌RNA提取方法提取效率的擴增圖譜

三、模擬痰樣檢測結果

通過熒光定量逆轉錄PCR檢測玻珠法提取的模擬痰樣組和未處理組結核分枝桿菌總RNA，結果如圖3所示。模擬痰樣組Ct值（28.93）略大于未加痰液組（25.57），說明玻珠法能有效提取模擬痰樣中的結核分枝桿菌總RNA。

圖3 熒光定量逆轉錄PCR檢測模擬痰樣擴增曲線圖

討 論

對于特殊生物樣本，如組織、革蘭陽性菌和真菌等，單獨使用異硫氰酸胍－酚－氯仿法并不能有效裂解細胞，導致RNA提取效率降低。因此，提取組織、革蘭陽性菌和真菌等生物樣本的RNA時，需在化學裂解細胞的基礎上輔助其他手段。如提取組織RNA常在Trizol（總RNA抽提試劑）前加入液氮中機械研磨，使組織充分分散破碎［10］。革蘭陽性菌多采用加入溶菌酶使細胞壁水解［11］。真菌RNA的提取可在Trizol的基礎上輔助碾磨、超聲波或玻珠等機械破碎方法［12－13］。

結核分枝桿菌細胞壁特殊，堅韌性較強，含有大量分枝菌酸、阿拉伯半乳糖成分，多糖和磷脂含量豐富。單純使用Trizol法提取結核分枝桿菌RNA較困難。由于結核分枝桿菌可通過空氣傳播，不適用液氮研磨；細胞壁中脂質含量高，對溶菌酶有一定的抗性。已報道的結核分枝桿菌總RNA提取方法中，Gill等［14］報道加入玻珠可提高提取效率；劉根焰［15］研究發現，超聲波能破碎結核分枝桿菌細胞壁，可得到用于PCR檢測的較高純度和質量的總RNA。因此，本實驗通過比較玻珠和不同功率超聲波聯合Trizol法，對結核分枝桿菌總RNA的提取方法進行優化。

通過熒光定量RT-PCR Ct值比較各實驗組RNA提取效率。結果顯示，超聲波組RNA Ct值小于Trizol組，說明超聲波有助于結核分枝桿菌細胞壁的破裂。不同功率試驗結果表明，隨著功率的增大，結核分枝桿菌RNA提取效率有一定程度的提高；但240W和400W組熒光定量RT-PCR Ct值接近，提示當功率增大到一定程度，超聲波對細菌的破碎效果可能達到平臺期。玻珠組RNA Ct值小于超聲波組，可能是玻珠振蕩對結核分枝桿菌細胞壁的破碎作用大于超聲波；也可能是超聲波在破碎細菌的同時會對RNA造成一定程度的斷裂。另外，玻珠法不需要特殊儀器，優于超聲波法，更利于推廣。模擬痰樣檢測結果也表明，玻珠法可有效提取痰液中結核分枝桿菌總RNA。

綜上所述，玻珠聯合Trizol法能夠快速、高效地提取結核分枝桿菌總RNA，有利于建立基于mRNA的熒光定量RT-PCR快速檢測活結核分枝桿菌。

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The comparison of different wall-breaking method for extracting total RNA ofMycobacterium tuberculosis

LUO Ying-shu＊，GAO Wen-feng，HUANG Ruo-ying，LIU Heng-chuan.＊Department ofMedical Technology，West China School ofPublic Health，Sichuan University，Chengdu 610041，China

：LIU Heng-chuan，Email：lhc54＠sohu.com

ObjectiveTo establish a simple and effective total RNA extraction method ofMycobacterium tuberculosis. Methods Cell wall ofMycobacterium tuberculosiswere treated by ultrasonic and glass-bead associated with Trizol method respectively，the total RNA was extracted and the influence of different total RNA extraction methods of Mtb were evaluated through fluorescent quantitative RT-PCR.The negative control is ultrapure water instead of template.Each method were extracted from 3samples for testing.The final result is the average of 3specimen. Results The Ct and△Rn value of glass-bead group is 20.67and 0.644，400Wultrasonic group is 22.09and 0.571，240Wultrasonic group is 21.86and 0.503，160Wultrasonic group is 25.21and 0.411，bead absent group is 28.40and 0.299，negative control is 40.00and 0.000. Conclusion The wall-breaking effection of glass-bead method is better than that of ultrasonic method.

Mycobacterium tuberculosis； RNA，bacterial； Reverse transcriptase polymerase chain reaction；Cell wall； Bacteriological techniques

610041成都，四川大學華西公共衛生學院醫學檢驗教研室（羅影殊、黃偌穎、劉衡川）；四川省疾病預防控制中心結核病預防控制所（高文鳳）

劉衡川，Email：lhc54＠sohu.com

2012-10-31）

（本文編輯：張曉進）