卡維地洛對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌重塑中Rho/Rock信號通路的影響

王靜 路明 任漪

心肌重塑包括心肌細胞肥大和心肌間質纖維化（myocardial fibrosis,MF），是心肌損傷或負荷增加后心室整體代償及繼發的病理生理反應過程。心肌重塑是各種原因導致的慢性心力衰竭發生、發展的決定性因素和病理學基礎[1]，因此，逆轉和減輕心室重塑有重要的意義。卡維地洛是一種具有多種受體阻滯作用的心血管藥物，Rho/Rock信號通路是多種組織細胞中普遍存在的一條信號轉導通路[2]。有研究表明，Rho/Rock信號通路廣泛參與心血管系統的各種生理病理進程，但在β-腎上腺素受體激動所致心肌重塑中的作用尚罕見有報道。本實驗主要觀察卡維地洛對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌重構中Rho/Rock信號通路的作用及轉化生長因子-β1（transforming growth fator-β1,TGF-β1）的影響。

1 資料與方法

1.1 主要藥品和試劑 卡維地洛片（北京巨能藥業公司生產），鹽酸異丙腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司），通用RT-PCR試劑盒，Trizol試劑盒，RhoA、Rho激酶引物，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌纖維化模型制備及分組 清潔級SD雄性大鼠24 只，體重160～200 g，于實驗室飼養1 周后隨機分成3組：空白對照組、ISO模型組、治療組,每組8 只。除對照組外，其余各組大鼠背部每天皮下注射ISO 5 mg/(kg·d)，連續10 d。給Iso同時，治療組每天給予Car 10 mg/(kg·d)，灌胃，模型組和對照組給予相同體積的生理鹽水灌胃，6 周后麻醉處死。

1.2.2 心臟病理學檢查 各組大鼠停藥12 h后，麻醉后開胸取出心臟，濾紙吸干，取心臟離心尖5 mm的左室中段橫截面。心肌標本于4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，常規石蠟包埋，進行連續切片，經MASSON染色，觀察心肌膠原變化，在Masson染色切片上每張隨機取10 個視野，測量心肌膠原百分比（CVF），作為心肌纖維化指標。

1.2.3 免疫組織化學染色檢測TGF-β1蛋白表達量 將包好的蠟塊4 μm切片，60℃烤片12 h，常規脫蠟，二甲苯透明，乙醇梯度水化，枸櫞酸緩沖液抗原修復后，滴加一抗，4℃過夜（以PBS代替一抗作陰性對照）；次日，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，最后DAB顯色，蘇木素對比染色，常規脫水透明中性樹膠封片，然后顯微鏡下觀察，使用Image-Pro Plus 4.0 軟件分析大鼠左室心肌中TGF-β1蛋白表達水平，用平均吸收灰度值（IOD）來表示相對含量。

1.2.4 RT-PCR方法檢測RhoA、Rho激酶mRNA的表達 取新鮮左室游離壁心肌組織約100 mg冰上勻漿后，按照Trizol說明書提取總RNA，核酸蛋白定量分析儀測定RNA的A 260/A 280 確定其濃度，取約2 μg總RNA按照RT-PCR試劑盒說明書要求進行。以β-actin作為內參照，β-actin上游引物：5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’,下游引物5’-AGCCATGCCAAATGTGTCAT-3’，產物大小為387 bp；RhoA上游引物5’-ACCAGTTCCCAGAGGTGTATGT-3’,下游引物5’-TTGGGACAGAAGTGCTTGACTTC-3’,產物大小為24 4 b p；R h o 激酶上游引物5’-G A G C A A C T A T G A T G T G C C T G A A A A A T-3’,下游引物：5’-GATGTCGTTTGATTTCTTCTAC-3’，產物大小512 bp，按照TaqTM說明書進行PCR，PCR產物用1%的EB染色，在自動CCD凝膠成像分析系統下觀察并拍攝電泳圖像，測定各條帶灰度值，以RhoA/β-actin，Rock/β-actin分別表示RhoA、ROCK的相對表達量。

1.3 統計學方法 所有數據采用SPSS 16.0 統計學軟件進行處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，多組均數間比較應用One-way ANOVA分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌組織病理學結果 模型組大鼠心肌纖維粗大，排列紊亂、斷裂。與對照組比較，模型組CVF明顯升高（P＜0.01）；治療組藥物干預后心肌纖維無斷裂，心肌間質輕度纖維化，與模型組比較，治療組CVF下降（P＜0.05），仍高于對照組。見表1、圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織MASSON染色（×400）

2.2 免疫組織化學法測定TGF-β1蛋白表達量 免疫組化結果顯示TGF-β1主要在心肌間質中表達，表達部位有棕黃色顆粒出現，對照組可見稀疏的棕黃色顆粒；模型組可見分布致密的棕黃色顆粒；治療組陽性顆粒較模型組表達少，仍高于對照組。用平均光密度值（IOD）比較各組中TGF-β1蛋白表達。模型組較對照組明顯升高（P＜0.01）；而治療組心肌中TGF-β1較模型組減少（P＜0.01）。見表1、圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織TGF-β1免疫組織化學染色（×400）

2.3 RT-PCR測定RhoA、Rho激酶（Rock 1）表達 與對照組比較，模型組RhoA、Rho激酶mRNA表達上調（P＜0.01），與模型組比較，治療組、RhoA、Rho激酶mRNA表達下調（P＜ 0.01），仍高于對照組，電泳結果如圖3，半定量分析結果見表1。

圖3 各組大鼠左室組織RhoA、RockmRNA表達，其中M為Marker

表1 心肌組織TGF-β1，RhoA、RockmRNA表達（±s，n=8）

表1 心肌組織TGF-β1，RhoA、RockmRNA表達（±s，n=8）

注：與對照組比較：aP＜0.01；與模型組比較：bP＜0.01

組別 CVF(%) TGF-β1 RhoA/β-actin Rock/β-actin 對照組 3.72±0.98 8.36±1.96 0.51±0.05 0.42±0.07模型組 5.73±0.56 a 28.13±3.28 a 1.35±0.07 a 0.90±0.10 a治療組 4.09±0.69 a 17.56±2.75 b 0.59±0.12 b 0.48±0.09 b

3 討論

心肌重塑包括心肌細胞肥大和心肌間質細胞及細胞外基質數量、質量及構型方式上的改變，是心功能由代償向失代償期轉變的重要病理過程，被認為是心源性死亡的獨立危險因素。本研究顯示，模型組大鼠的CVF心肌重塑和纖維化的指標明顯高于對照組（P＜0.01），證明模型組大鼠出現左室心肌重塑，與以往文獻[3]報道一致。

TGF-β1是成纖維細胞的強趨化因子，可直接刺激其細胞外基質蛋白合成、抑制膠原降解，使細胞外基質大量沉積于心肌細胞周圍，從而導致心肌纖維化[4]。本組實驗中模型組大鼠心肌TGF-β1蛋白表達明顯高于對照組，說明TGF-β1參與了ISO誘導的心肌重塑和纖維化，TGF-β1蛋白含量高低可能在心肌纖維化評估中有重要意義。

近年的研究發現，心肌重塑的發生與發展與一系列的信號轉導通路激活密切相關[5]。Rho/Rock信號通路是多種組織細胞中普遍存在的一條信號轉導通路。研究認為，Rho/Rho激酶作為一個分子開關，可上調促進炎癥、氧化應激和纖維化的各種因子，下調內皮型一氧化氮合酶，而這些因素已經被證明均有較強的致心肌重塑作用。β受體阻滯劑因其阻滯神經激素、阻斷信號通路，從而阻斷心肌重塑的作用，近年來已作為臨床用藥。其中卡維地洛是一種非選擇性兼具血管擴張作用的β受體阻滯劑，其主要藥理作用是阻斷β1受體、降低心臟的交感神經敏感性，使心率減慢；抑制由β2受體介導的交感神經活動；阻斷突觸前β2受體和α1受體，擴張外周血管，減輕心臟負荷，增加心輸出量。

在本實驗中，模型組大鼠CVF 和TGF-β1蛋白表達均增高的同時RhoAmRNA和RockmRNA表達亦增加，治療組應用卡維地洛6 周后，CVF較模型組降低，心肌纖維化程度減輕，RhoA-mRNA和Rock-mRNA表達及TGF-β1蛋白含量明顯減少，且差異有統計學意義，提示卡維地洛能阻止β受體興奮所誘導的心肌重塑中Rho/Rock信號通路和纖維化的發生發展，近年許多臨床試驗證實腎上腺素能β2受體阻滯劑能改善心肌纖維化患者癥狀，延緩心肌重塑。

綜上所述，卡維地洛可抑制ISO誘導心肌纖維化Rho/Rock信號轉導通路的活性、抑制TGF-β1表達，減輕心肌纖維化。因此卡維地洛在治療心肌重塑中具有明顯的優勢和廣闊的前景。

[1]Hiyoshi H,Yayama K,Takano M,et al.Stimulation of cyclic GMP production via AT 2 and B 2 receptors in the pressure-overloaded aorta after banding [J].Hypertension,2004,43(6):1258-1263.

[2]Auer M,Schweigreiter R,Hausott B,et al.Rho-independent stimulation of axon outgrowth and activation of the ERK and Akt signaling pathways by C 3 transferase in sensory neurons[J].Front Cell Neurosci,2012（6）:43.

[3]Zhang YG,Li YG,Liu BG,et al.Urotensin II accecerates cardiac fibrosis and hypertrophy of rat induced by isoproterenol[J].Acta pharmacol Sin,2007,28(1):36-43.

[4]Xu T,Wu M,Feng J,et al.RhoA/Rho kinase signaling regulates transforming growth factor-β 1-induced chondrogenesis and actin organization of synovium-derived mesenchymal stem cells through interaction with the Smad pathway[J].Int Jmed,2012,30(5):1119-1125.

[5]Takemoto Y,Yoshiyama M,Takeuchi K,et al.Increased JNK,AP-1 and NF-kappaB DNA binding activities in isoproterenol-induced cardiac remodeling[J].Mol Cell Cardiol,1999,31(11):2017-2030.