夏枯草水提液對人甲狀腺細胞NO生成及其與攝碘率相關性影響

劉新宇， 劉春娜， 鄭久明

（1.遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121001；2.遼寧醫學院藥理學教研室，遼寧錦州 121001）

夏枯草水提液對人甲狀腺細胞NO生成及其與攝碘率相關性影響

劉新宇1， 劉春娜2*， 鄭久明2

（1.遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121001；2.遼寧醫學院藥理學教研室，遼寧錦州 121001）

目的 旨在觀察中藥夏枯草水提液對人甲狀腺細胞一氧化氮 （NO）生成、攝碘率及鈉/碘轉運體 （NIS）表達的影響，探討其增強甲狀腺細胞碘攝取的分子機制。方法 選用人甲狀腺腺瘤旁正常甲狀腺組織，采用細胞原代培養方法及半定量逆轉錄聚合酶鏈反應 （RT-PCR）技術，觀察夏枯草水提液對體外培養人甲狀腺細胞NO生成、碘攝取及NIS表達的影響。結果 經促甲狀腺激素 （TSH）（200 μIU/mL）處理的人甲狀腺細胞，夏枯草水提液抑制其NO的生成，增強碘的攝取及NIS的表達，其中夏枯草 （100 g/L）作用最強，并且后二者呈正相關 （r=0.88）。結論

目前，中藥夏枯草在臨床上主要用于治療甲狀腺腫大、瘰疬、淋巴結核、癭瘤、乳癰、肺結核、乳癌、筋骨疼痛、急性傳染性肝炎等。臨床上用夏枯草治療甲狀腺疾病已有久遠的歷史，夏枯草可輔助治療甲狀腺功能亢進、亞急性甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、單純性甲狀腺腫和甲狀腺功能減退［1］，在細胞水平夏枯草可促進甲狀腺癌細胞凋亡［2］，增加甲狀腺癌細胞碘的攝取及鈉/碘轉運體 （NIS）的表達［3］，但夏枯草與甲狀腺細胞碘攝取之間的關系尚缺乏進一步的探討。本實驗主要觀察夏枯草對體外培養人甲狀腺細胞碘攝取的影響，驗證該作用與一氧化氮 （NO）是否相關，探討其對甲狀腺細胞碘攝取影響的分子機制。

1 實驗材料

1.1 甲狀腺組織取材方法及實驗分組 甲狀腺腺瘤旁正常的甲狀腺組織 （遼寧醫學院附屬第一醫院手術室提供）。

1.2 夏枯草水提液配制 40 g夏枯草加蒸餾水400 mL，煮沸30 min后過濾除渣，熬制成濃縮液并定容至40 mL，濾液濃縮質量濃度為1 g/mL，經120℃ 30 min高壓滅菌，用直徑為22 μm的微孔濾膜正壓過濾。按藥物質量濃度分為4個質量濃度組 （0、50、100、200 g/L）。

1.3 試劑與儀器 牛TSH、F-12培養基：Sigma公司；MMLV：Promega公司；NO檢測試劑盒：南京建成生物公司；GibcoBRL公司；Trizol試劑：Na125I：由中國人民解放軍205醫院同位素科惠贈。

2 方法

2.1 甲狀腺細胞培養 手術中剝離甲狀腺腺瘤旁正常甲狀腺組織，以無鈣鎂Hank's液沖洗2次，剪碎。0.25% 膠原酶消化和0.25% 胰酶60 min，1 200 r/min離心10 min，將離心后的沉淀物制成細胞懸液，懸于含有15%胎牛血清和200 μIU/mL促甲狀腺激素 （TSH）的F-12培養液當中。采用臺盼藍染色證明活細胞＞95%，調整細胞數 （5×105）并接種于培養瓶，37℃，CO2孵箱中培養，48 h換液。

2.2 測定NO 將甲狀腺細胞接種于24孔培養板，貼壁生長72 h，加入夏枯草 （0、50、100、200 g/L），各藥物質量濃度接種8復孔，硝酸還原酶法，550 nm處測定吸光度值。觀察經夏枯草孵育 （24 h、48 h、72 h）后對NO產生的影響。

2.3 碘攝取率的測定 將甲狀腺細胞細胞接種于24孔培養板，貼壁生長 72 h，加入夏枯草 （0、50、100、200 g/L），各藥物質量濃度接種8復孔，孵育24 h，用1 mL冷HBSS漂洗2次。10 μmol/L的KI，內含0.000 5 mL Na125I（15 000 cpm），37℃，水浴40 min，冰的HBSS漂洗2次。加入0.5 mL HBSS（內含20 mmol/L KClO425 μL），37℃，30 min后γ-記數器記數。觀察經夏枯草孵育 （24 h、48 h、72 h）后對碘攝取率的影響。

2.4 NIS mRNA檢測 采用半定量RT-PCR方法進行檢測。將上述細胞置于含夏枯草 （0、50、100、200 g/L）中，孵育24 h，Trizol試劑提取總 RNA。以逆轉錄酶 （M-MLV）進行逆轉錄，β-actin：順 5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'， 反 5'-CTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'，PCR引 物 NIS：5'-CTCCCTGCTAACGACTCCAG-3'，反 5'-AACAGACGATCCTCATTGGTG-3'，擴增片段長度分別為392 bp及661 bp。PCR的反應條件為97℃ 5 min、93℃ 3 min，預變性，93℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 45 s，共計30個循環，72℃ 7 min末循環。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠 （含溴乙錠）進行電泳，以100 bp ladder DNA為標志物，結果用Kodak Digital 1D Image A-nalysis Software成像系統掃描，測定各組光密度值，計算NIS/β-actin光密度比值。觀察經夏枯草孵育 （24 h、48 h、72 h）后對NIS mRNA表達的影響。

2.5 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件，數據以均數±標準差 （±s）表示。兩組平均值比較采用非配對t檢驗。兩組以上均值的比較采用隨機設計方差分析q檢驗。P＜0.05為具有顯著性差異，P＜0.01為差異極顯著。

3 實驗結果

夏枯草水提液 （50、100、200 g/L）體外培養能夠顯著抑制人甲狀腺細胞產生NO，增強甲狀腺細胞碘攝取，同時增強人甲狀腺細胞NIS mRNA的表達，其中100 g/L質量濃度的作用最強 （表1），可顯著抑制甲狀腺細胞產生NO，呈時間依賴性，孵育48 h對于增強碘的攝取及NIS mRNA表達最顯著 （表2）。經對培養人甲狀腺細胞碘攝取與對NIS mRNA表達的影響進行相關性分析，二者呈正相關（r=0.88）。

表1 不同質量濃度夏枯草水提液對培養人甲狀腺細胞NO、攝碘率和NIS表達的影響

表2 夏枯草水提液不同時間對培養人甲狀腺細胞NO、攝碘率及NIS表達的影響

4 討論

夏枯草是臨床經典的治療甲狀腺疾病的輔助中藥，能增強甲狀腺癌細胞碘的攝取及NIS的基因表達［3］，但其作用機制尚無報道。NO已被確認是甲狀腺細胞及各組織內重要的信息分子，參與多種甲狀腺生理及病理過程，本實驗室已研究證實NO能抑制體外培養甲狀腺細胞碘攝取、NIS mRNA表達、碘有機化以及介導脂多糖 （LPS）對NIS的影響［6，9-11］。

本實驗顯示夏枯草可以抑制體外培養人甲狀腺細胞NO的產生，提高細胞對碘的攝取，增強NIS mRNA的表達，并呈正相關 （r=0.88），結果提示夏枯草提高甲狀腺細胞的碘攝取，其可能的機制是由其增強NIS mRNA的表達，而通過抑制甲狀腺細胞NO的產生發揮作用。NIS受到多種因子的調控，如促甲狀腺維激素、全反式維甲酸、環磷酸腺苷 （cAMP）等可以上調NIS的表達，高碘、某些細胞因子及糖皮質激素等則起到下調的作用［12］。某些細胞因子如IL-α及IL-β能夠刺激人甲狀腺細胞內誘生性一氧化氮合酶（iNOS），其作用強而持久的NO［13］，這些細胞因子抑制碘攝取可能是通過NO介導，而夏枯草是否能抑制NOS仍需進一步探討。研究表明，NO發揮其主要病理生理作用，是通過激活甲狀腺細胞鳥苷酸環化酶介導的cGMP生成這條途徑來實現［4］，研究也發現，cGMP類似物能抑制牛甲狀腺細胞碘的攝取［14］。甲狀腺細胞對碘的攝取是通過Na+-K+-ATP酶提供能量，NO已被證明能抑制甲狀腺細胞膜Na+-K+-ATP酶的活性［6］，夏枯草對 Na+-K+-ATP酶的影響尚待進一步證明。當然，夏枯草對甲狀腺細胞碘攝取的影響可能存在多種機制，但NO在其中必定起重要作用。總之，深入研究夏枯草與甲狀腺之間的內在聯系將有助于進一步了解其藥理作用，為臨床治療甲狀腺相關疾病提供更為豐富的理論基礎。

［1］吳勝本.夏枯草口服液在Graves病治療中的應用［J］.中成藥，2012，34（1）：10-11.

［2］張 靜，王 瑛，趙華棟，等.中藥夏枯草對人甲狀腺癌細胞系SW579增殖周期及凋亡的影響［J］.現代生物醫學進展，2011，11（23）：4434-4436.

［3］張王峰，付 強，趙華棟，等.中藥夏枯草對甲狀腺癌細胞NIS基因表達及攝碘率的影響［J］.第四軍醫大學學報，2008，29（9）：826-828.

［4］Esteves R Z，van Sande J，Dumont J E.Nitric oxide as a signal in thyroid［J］.Mol Cell Endocrinol，1992，90（1）：R1-R3.

［5］Bazzara L G，Vélez M L，Costamagna M E，et al.Nitric oxide/cGMP signaling inhibits TSH-stimulated iodide uptake and expression of thyroid peroxidase and thyroglobulin mRNA in FRTL-5 thyroid cells［J］.Thyroid，2007，17（8）：717-727.

［6］劉新宇，劉春娜，劉用璋，等.一氧化氮對人甲狀腺細胞鈉-碘轉運體的影響［J］.中國地方病學雜志，2004，23（3）：207-210.

［7］張麗丹，蘇 潔，呂圭源，等.夏枯草的藥理研究與臨床應用［J］.海峽藥學，2011，23（5）：143-145.

［8］顧曉潔，錢士輝，李友賓，等.夏枯草的化學成分及藥理作用研究進展［J］.中國野生植物資源，2007，26（2）：5-7.

［9］劉新宇，劉春娜.一氧化氮對人甲狀腺細胞鈉/碘轉運體的基因調節作用［J］.中國藥房，2010，21（1）：28-29.

［10］劉新宇，劉春娜，劉用璋，等.一氧化氮供體硝普鈉對人甲狀腺細胞碘有機化的影響［J］.中華內分泌代謝雜志，2006，22（2）：147-148.

［11］劉新宇，劉春娜.脂多糖對人甲狀腺細胞鈉/碘轉運體的基因調節作用［J］.廣東醫學，2009，30（12）：1788-1789.

［12］Dohán O，De la Vieja A，Paroder V，et al.The sodium iodide symporter（NIS）：characterization，regulation，and medical significance［J］.Endocr Rev，2003，24（1）：48-77.

［13］van den Hove M F，Stoenoiu M S，Croizet K.et al.Nitric oxide is involved in interleukin-lα induced cytotoxicity in polarised human thyrocytes［J］.J Endocrinol，2002，173（1）：177-185.

［14］Costamagana M E，Cabanillas A M，Coleoni A H，et al.Nitric oxide donors inhibit iodide transport and organificafion and induce morphological changes in cultured bovine thyroid cells［J］.Thyroid，1998，8（12）：1127-1135.

R285.5

B

1001-1528（2013）05-1065-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.05.049

2012-08-30

遼寧省科學技術計劃項目 （2010225034），遼寧省教育廳創新團隊項目 （LT2010065）

劉新宇 （1976—），男，副教授，碩士，研究方向：中藥內分泌。Tel：13504064376

*通信作者：劉春娜 （1977—），女，副教授，博士，研究方向：神經藥理學。Tel：（0416）4673465，E-mail：springnanaliu@163.com夏枯草水提液能抑制甲狀腺細胞NO生成，提示增強甲狀腺細胞碘的攝取是通過抑制NO合成來實現的。關鍵詞：夏枯草；水提液；甲狀腺細胞；一氧化氮；鈉/碘轉運體；攝碘率；促甲狀腺激素