LC-MS/MS 法同時測定口炎清顆粒中8種成分

張子建， 孫冬曉， 王 婧， 董立華， 郭盼盼， 王春英*

（1.河北省中醫(yī)院口腔科，河北 石家莊050011；河北醫(yī)科大學藥學院藥物分析教研室，河北 石家莊050017；河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院藥劑科，河北石家莊 050031）

LC-MS/MS 法同時測定口炎清顆粒中8種成分

張子建1， 孫冬曉2， 王 婧3， 董立華2， 郭盼盼2， 王春英2*

（1.河北省中醫(yī)院口腔科，河北 石家莊050011；河北醫(yī)科大學藥學院藥物分析教研室，河北 石家莊050017；河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院藥劑科，河北石家莊 050031）

目的 建立用液相色譜-串聯質譜法同時測定口炎清顆粒 （天冬、麥冬、玄參、山銀花、甘草）中8種成分的方法。方法 采用C18色譜柱，以甲醇-水為流動相，梯度洗脫。采用混合線性離子肼，電噴霧離子源，多反應離子檢測和負離子模式進行掃描，對口炎清顆粒中哈巴苷、甘草苷、綠原酸、肉桂酸、甘草酸、甘草次酸、魯斯可皂苷元、菝契皂苷元等8種化學成分進行同時檢測。結果 所有被測物的線性關系良好 （r＞0.999）；方法回收率為100.5%～107.6%，RSD為1.3%～3.2%。結論 此方法準確，快速，重復性好，有望為口炎清顆粒的質量控制提供依據。

口炎清顆粒；液相色譜-串聯質譜；質量控制

口炎清顆粒是由天冬，麥冬，玄參，山銀花和甘草五味中藥組成的復方制劑，具有滋陰清熱，解毒消腫之功效，用于治療陰虛火旺所致的口腔疾病［1-3］。目前，對于該制劑的質量控制主要是以綠原酸為指標成分的高效液相色譜法［1，4-5］。雖有文獻對口炎清顆粒的指紋圖譜進行了研究，并對一些色譜峰進行了歸屬研究，但缺乏定量數據，并且由于采用的是高效液相色譜法，分析周期長達2 h［6］。液質聯用 （LC-MS/MS）技術具有專屬性好，靈敏度高和快速高效的特點，已逐漸成為中藥成分定量分析的有效方法［7-8］。本研究采用混合線性離子肼，電噴霧離子源，多反應離子檢測和負離子模式進行掃描，同時測定口炎清顆粒中哈巴苷、甘草苷、綠原酸、肉桂酸、甘草酸、甘草次酸、魯斯可皂苷元和菝契皂苷元8種成分，為口炎清顆粒的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

3200 Q-Trap型串聯三重四級桿質譜儀，Analyst 1.4.2分析軟件 （美國AB公司）；Agilent 1200液相色譜儀，包括G1311A型四元梯度洗脫泵，G1329A型自動進樣器和G1322A型在線脫氣儀（美國 Agilent公司）。口炎清顆粒 （規(guī)格：10 g/袋，批號為 C1A028，D2A012，C2A020，廠家為廣州白云山和記黃埔中藥有限公司）。菝契皂苷元、魯斯可皂苷元、哈巴苷和甘草酸對照品 （南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司），肉桂酸和綠原酸對照品 （中國食品藥品檢定研究院），甘草苷和甘草次酸對照品 （上海寶曼生物科技有限公司），所有對照品純度均大于98%。甲醇 （色譜純，Fisher公司），甲酸及其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；流動相為甲醇 （A）-水 （B），梯度洗脫 （A∶B為0～4 min，20∶80～60∶40；4～6 min，60 ∶40～95 ∶5；6～14 min，95 ∶5；14～14.1 min，95∶5～20∶80）；柱溫 35℃；體積流量0.8 mL/min；進樣量5 μL。

2.2 質譜條件 電噴霧離子源；多反應離子監(jiān)測，采用負離子模式掃描，源噴射電壓－4 500/5 500 V；溫度650℃；氣簾氣 25 psi（1 psi=6.895 kPa）；霧化氣60 psi，輔助氣 65 psi。8種被測成分的化學結構、二級譜圖、監(jiān)測離子對、出峰時間、解簇電壓和碰撞電壓見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取8種對照品適量，各置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取各貯備液適量，置10 mL量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，得各化合物的混合對照品溶液。對照品溶液的色譜圖見圖2。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取顆粒劑細粉約2.5 g，加入50%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理1 h，冷至室溫，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液即得。供試品溶液的色譜圖見圖2。

2.4 線性關系與定量限 精密量取混合對照品溶液適量，用50%甲醇定量稀釋制得系列質量濃度梯度的混合對照品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。以對照品質量濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程，結果見表1。

表1 口炎清顆粒中8種被測成分的回歸方程，相關系數，線性范圍及最低定量限Tab.1 Regression equation，correlation coefficient and quantitation limits of the 8 components in Kouyanqing Granules

2.5 精密度試驗 取供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算哈巴苷、綠原酸、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、甘草次酸、魯斯可皂苷元和菝契皂苷元峰面積的 RSD分別為2.5%、1.4%、0.9%、3.1%、1.5%、1.8%、2.1%、3.2%。表明該方法具有較好的精密度。

2.6 穩(wěn)定性試驗 將供試品溶液于室溫下放置0、2、4、6、8和12 h，分別進樣，記錄峰面積，計算哈巴苷、綠原酸、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、甘草次酸、魯斯可皂苷元和菝契皂苷元峰面積的RSD 分 別 為 2.7%、2.1%、1.2%、2.4%、1.6%、1.4%、1.7%、2.5%，表明供試品溶液室溫放置12 h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一批號的供試品細粉6份，按2.3.2項下的方法制備供試品溶液，進樣測定，計算哈巴苷、綠原酸、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、甘草次酸、魯斯可皂苷元和菝契皂苷元含有量的RSD分別為1.6%、2.4%、1.8%、3.1%、0.8%、1.7%、2.5%、2.9%，表明該方法的重復性良好。

圖1 口炎清顆粒中8種被測成分的化學結構、二級質譜圖、監(jiān)測離子對、出峰時間、解簇電壓和碰撞電壓Fig.1 Chemical structures，the product ion spectra，MS/MS fragment ions，declustering potential（DP）and collision energy（CE）of the 8 components in Kouyanqing Granules

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取同一批號已知含有量的供試品細粉6份，每份1.25 g，分別精密加入各被測組分以50%甲醇為溶解的混合對照品貯備液10 mL，及50%甲醇40 mL，按2.3.2項下的方法操作，進樣測定，計算各成分的平均回收率，結果見表2。

圖2 對照品溶液 （A）和供試品溶液 （B）的總離子流色譜圖 （a）和提取離子色譜圖Fig.2 Total ionschromatograms（a）and extract ions chromatograms of standard solution（A）and sample solution（B）

2.10 樣品測定 取口炎清顆粒3批，分別按2.3.2項下的方法處理，進樣測定，計算各化合物的質量分數，結果見表3。

3 討論

3.1 測定成分的選擇 口炎清顆粒由五味中藥組成，《中國藥典》及其他文獻報道只選擇了山銀花中的綠原酸為定量指標成分。本試驗從每味中藥中選擇1～3個主要化學成分為測定指標，具體如下：天冬中的菝契皂苷元［9］；麥冬中的魯斯可皂苷元［10］；山銀花中綠原酸［11］；玄參中的哈巴苷和肉桂酸［12］；甘草中的甘草苷、甘草酸和甘草次酸［3］。由于此方法能夠兼顧到制劑組方中的每一味藥，故能較全面的控制該制劑的質量。

表2 口炎清顆粒中8種被測成分的回收率 （n=6）Tab.2 Recoveries of 8 components in Kouyanqing Granules（n=6）

表3 樣品測定結果 （n=3）Tab.3 Results of sample analysis（n=3）

3.2 綠原酸的定量 在對綠原酸進行檢測時，無論是選擇m/z353.1→191.0，還是其他離子對，在其對照品和樣品色譜圖上均出現兩個色譜峰。據文獻報道［14］，因為綠原酸的分子結構中存在雙鍵結構，其在水溶液以順反兩種異構體的形式存在，并且互相轉化，直至達到平衡。因此在定量時應按兩色譜峰之和計算。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：465

［2］曾憲濤.他克莫司軟膏加口炎清顆粒治療糜爛型OLP的療效評價［J］.臨床口腔醫(yī)學雜志，2011，27（7）：432-433.

［3］于 飛.地塞米松磷酸鈉聯合口炎清顆粒治療口腔糜爛型扁平苔蘚［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（18）：206，209.

［4］梅 林，袁 英，胡承波.高效液相色譜法測定口炎清顆粒中綠原酸含量［J］.中國藥業(yè)，2007，16（5）：15.

［5］羅 杰，楊東升，歐陽慧芳，等.口炎清顆粒（無糖型）中綠原酸的含量測定［J］.中國中藥雜志，2003，28（8）：780-781.

［6］關倩怡，黃 琳，彭 維，等.口炎清顆粒指紋圖譜研究［J］.中山大學學報：自然科學版，2011，50（1）：115-118.

［7］Qiao Shi，Shi Rui，Liu Man，et al.Simultaneous quantification of flavonoids and phenolic acids inHerba Scutellariae barbataeand its confused plants by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Food Chem，2011，129（3）：1297-1304.

［8］班麗娜，徐遠金.HPLC/MS同時測定雙黃連口服液中的4種有效成分［J］.中成藥，2012，34（2）：265-268.

［9］徐從立，陳海生，譚興起，等.中藥天冬的化學成分研究［J］.天然產物研究與開發(fā)，2005，17（2）128-130.

［10］黃寶美，姚程煒，邊清泉，等.非水毛細管電泳法同時測定麥冬中薯蕷皂苷元和魯斯可皂苷元的含量［J］.藥學學報，2011，46（4）：443-446.

［11］柴興云，李 萍，唐力英.山銀花化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2004，29（9）：865-866.

［12］師 怡，許 暉，闕慧卿，等.玄參化學成分的藥理作用和分析方法［J］.海峽藥學，2006，18（4）：58-60.

［13］吳昭暉，羅佳波，游文瑋.甘草藥材HPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2005，36（12）：1868-1872.

［14］Clifford M N，Kirkpatrick J，Kuhnert N，et al.LC-MSnanalysis of the cis isomers of chlorogenic acids［J］.Food Chem，2008，106（1）：379-385.

Simultaneous determination of eight components in Kouyanqing Granules by LC-MS/MS

ZHANG Zi-jian1， SUN Dong-xiao2， WANG Jing3， DONG Li-hua2， GUO Pan-pan2， WANG Chun-ying2*
（1.Department of Stomatology，Hebei Provincial TCM Hospital，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Pharmaceutical Analysis，School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；3.Department of Pharmacy，The First Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China）

AIMTo establish a LC-MS/MS method for simultaneously determining eight components in Kouyanqing Granules（Asparagi Radix，Ophiopogonis Radix，Scrophulariae Radix，Lonicerae Flos，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）.METHODSA C18column was used with the mobile phase of methanol-water（containing 0.5 mmol/L ammonium acetate and 0.1%formic acid）in gradient elution mode.Analytes（harpagide，liquiritin，chlorogenic acid，cinnamic acid，glycyrrhizic acid，glycyrrhetinic acid，ruscogenin and sarsasapogenin）were detected using a hybrid quadrupole linear ion trap mass spectrometer that was equipped with an electrospray ionization source operating in the negative and multiple-reaction monitoring（MRM）modes.RESULTSAll the components showed good linearity（r＞0.999）.Their recoveries were 100.5% －107.6%with RSDs of 1.3%-3.2%.CONCLUSIONThe developed method is accurate，sensitive，rapid and suitable for the quality control of Kouyanqing Granules.

Kouyanqing Granules；LC-MS/MS；quality control

R927.2

A

1001-1528（2013）05-0952-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.05.020

2012-12-26

河北省自然基金-石藥集團醫(yī)藥聯合研究基金資助項目 （C2011206170）；河北省教育廳自然科學指令性課題 （2009147）

張子建 （1972—），男，主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事口腔醫(yī)學研究。Tel：（0311）66792669，E-mail：zjzh3@163.com

*通信作者：王春英 （1972—），女，博士，副教授，主要從事中藥質量控制和體內過程研究。Tel：（0311）86265625，E-mail：wangcy730301@163.com