不同類型土壤和植物對柴油微生物降解的影響

陸泗進，何立環，孫 聰，彭福利

(中國環境監測總站，北京100012)

加油站地下儲藏罐 (underground storage tanks，USTs)泄漏引起土壤及地下水遭受柴油等油類污染物的污染是一個嚴重而普遍的環境問題。美國環保局對2001年9月以前的有關地下油罐污染狀況的數據進行了統計，全美國已被確認的有滲 (泄)漏問題的地下油罐接近42萬個［1］。到2003年仍有14萬由于滲 (泄)漏造成污染的地點在等待清理整治［2］。中國的加油站滲 (泄)漏狀況比美國要嚴重得多，雖然尚無這方面的系統調查工作，但已是一個不爭的事實［3］。這些泄露的柴油等污染物，可輕易進入包氣帶土壤，進而滲入到地下水系統，污染地下水［4，5］。其具有致癌、致變、致畸等作用，并易于在生物體內富集，嚴重危及人類健康和影響生態平衡。

大量研究表明，在土壤油類污染凈化的綜合因素中，微生物降解起著重要作用，很多具有降解特性的菌株也陸續被分離出來。如何提高降解菌株在土壤中的數量和活性，最大程度促進降解，成為人們亟待解決的問題。但微生物降解污染物往往受到很多環境因素的影響，如在不同類型土壤中，菌株降解污染物能力可能都不盡相同，而且植物根系的生長以及分泌物都有可能對微生物的生長和降解造成一定的影響［6，7］。為此，本研究擬從加油站污染土壤中篩選出對柴油具較強降解能力的菌株，比較研究在存在植物 (苜蓿和芥菜)情況下，菌株在不同類型土壤中對柴油污染物降解情況。通過以上研究以期為將來進行加油站汽泄漏油污染現場修復提供理論參考和新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離與鑒定

污染土壤樣品取至已建站4a的北京市某加油站的儲油罐附近 (2m深)。

采用富集培養的方法分離出一株對柴油具有較強降解能力的菌株Q18。結合形態特征以及生理生化特征分析，初步確定菌株 Q18為紅球菌(Rhodococcus sp．)。

1.2 供試植物

本實驗供試植物采用苜蓿和芥菜。將買至種子站的苜蓿和芥菜的種子放在4℃冰箱中，低溫催化，放置7d后，種子采用10%H2O2浸泡10min，去離子水沖洗，然后用水浸泡催芽。苗床育苗，14d后，從苗床上挖取長勢一致的幼苗，用蒸餾水洗凈根系泥土，供栽培用。

實驗采用250W照明金屬鹵化物燈為植物提供生長所需的光能，光強為4900μW/cm2，光照長度為12h/d。

1.3 柴油降解實驗

采用溫室土培的方式進行土壤柴油降解實驗。按照實驗設計 (表1)，將需要污染的土盆按5g/kg的油土比加入500mg柴油，充分混勻;然后向需要加入降解菌的土盆中加入25ml菌懸液;最后按照實驗設計，從苗床上挖取長勢一致的植物幼苗，用蒸餾水洗凈根系泥土，移栽到土盆里。同時設空白對照試驗。各實驗均做3次重復。培養1d、2d、3d、4d和5d后，從土盆中三處不同部位分別取一定量土壤，充分混勻后，取5 g土樣分別測定土壤中柴油含量。采用Schwab等的方法提取土壤中柴油［8］，含量測定采用紫外分光光度計法 (Varian Cary－50 Probe)。

表1 降解實驗設計

考慮到柴油的揮發性，以及某些非生物降解損失，設計了2組空白實驗 (表1)。第一組實驗，作為整個實驗的空白對照，土壤中除沒有加入柴油、植物和菌株外，其余條件保持一致。第二組實驗，土壤加入柴油污染，而無植物和菌株，即除不加菌株和植物外，其余條件保持一致，通過測定實驗前后柴油含量的變化得到因揮發和非生物降解等原因減少的柴油量，然后在各實驗結果中進行相應扣除即可消除柴油揮發、淋失及其它非生物降解等的影響。

為了得到菌株單獨降解土壤中柴油污染物的能力，設計了第三組實驗，即污染土壤，并加入菌株，但沒有植物;為了考察菌株和植物復合系統降解柴油的能力，設計了第四組實驗，即污染土壤，并加入菌株和植物。具體的降解實驗設計見表1。

土培試驗采用的土壤取至無油類污染場地，土樣室溫下風干后，過2mm的篩，然后將土樣分2次在120℃下加熱30min進行滅菌。土壤的基本性質見表2。

表2 土培降解實驗土壤的基本性質

2 結果與討論

2.1 砂壤土中的柴油降解

實驗中的溫度、pH和土壤含水量分別控制為30℃、6.0和30%。在此條件下，菌株和植物均生長良好。

菌株Q18以及菌株與植物苜蓿、芥菜的復合體系在砂壤土中，培養一定時間后，剩余柴油的濃度列于表3。

表3 降解后剩余柴油的濃度 (平均值±方差) (g/kg)

由表3可以看出，隨時間的增加，土壤中殘留的柴油濃度逐漸減少，即降解的柴油量逐漸增加。很容易計算出，菌株Q18、菌株Q18－苜蓿以及菌株Q18－芥菜復合體系5d內柴油總的降解率依次為46.28%、63.55%和69.18%。可見，菌株Q18對土壤中柴油污染物具有較強的降解能力，而且菌株Q18復合植物苜蓿和芥菜后，柴油降解率大大提高。其降解能力順序為:菌株Q18－芥菜＞菌株Q18－苜蓿＞菌株Q18。

在不同的時間段內，柴油的降解率也很容易計算出，其結果見圖1。由圖1可以看出，在砂壤土中，隨時間的增加，菌株Q18對柴油的降解率先依次增大后逐漸減少，在3d時降解率達到最大(9.50%)。這說明，菌株投入土壤后，可能需要一定的時間來適應土壤環境條件，隨著對土壤環境的適應，菌株開始逐漸增殖、擴散，數量及活性增加，導致降解率提高，但隨著菌株的成熟和衰老，菌株數量及活性又會下降，這樣降解率也會逐漸降低。因此，曲線整體呈現鐘形。菌株與植物的復合體系對柴油的降解率隨時間的變化關系也與此基本類似。不過曲線上升更快，下降也更為平緩。這表明，植物苜蓿和芥菜的存在可能對菌株Q18的數量和活性有較大的影響。

另外，由圖1也可以看出，在每個時間段菌株Q18和芥菜的復合體系對柴油的降解率都最大，其次為菌株Q18和苜蓿的復合體系，菌株Q18最小。這說明，不論芥菜還是苜蓿與菌株Q18復合，都能有效提高柴油的降解，且菌株Q18和芥菜的復合體系降解柴油能力更強。

在預備實驗中，研究了植物芥菜和苜蓿單獨對土壤中柴油的降解能力。實驗結果表明，在本實驗條件下，種植植物芥菜和苜蓿前后 (5d)，土壤中柴油的濃度基本沒有變化，即植物芥菜和苜蓿對柴油可能基本沒有降解能力。這說明，柴油主要還是被菌株Q18所降解，苜蓿和芥菜可能主要起到強化菌株Q18降解柴油的作用。菌株與植物復合體系之所以能提高降解率，主要原因可能是植物和菌株間的相互作用。可能由于植物的存在，提高了菌株Q18的數量和活性，強化了降解。由于植物芥菜和苜蓿都具有較為發達的根系，且能深入土壤，表面積也較大，在其生長過程中，根系疏松了土壤，使土壤更為通氣，還可能分散了柴油。此外，根系的分泌物不僅能為菌株提供營養物質從而活化菌株，還可能與柴油螯合而活化柴油，促進了降解的發生。因此，植物的存在及根系的生長可能改變了土壤環境，使其更適宜菌株的生長和降解，在這些因素的綜合作用下導致菌株Q18數量和活性的提高，促進了柴油污染物的降解。

2.2 砂土和粘土中柴油的降解

為了考察不同類型土壤對菌株降解柴油的影響，實驗研究了在砂土和粘土中，菌株Q18及菌株植物復合體系對柴油的降解情況。實驗條件均與上述實驗一致。

菌株對柴油的降解率隨時間的關系如圖2和圖3。

由圖2、圖3可以看出，在砂土和粘土中，柴油的降解率也是隨時間增加先依次增大而后逐漸減少，在3d時降解率最大，降解能力大小順序也是菌株Q18和植物的復合體系大于菌株Q18，這也與圖1變化趨勢基本類似。不過，曲線增長和下降幅度不盡相同，而且在砂土中，菌株Q18與苜蓿復合體降解柴油能力最強;在粘土中，則是菌株Q18與芥菜復合體降解柴油能力最強。這說明，不同的土壤類型對于菌株Q18及菌株植物復合體系降解柴油具有明顯的影響，但不管在哪種類型土壤中，植物活化作用都是顯著存在的。只是，植物強化菌株降解柴油的能力可能在不同類型土壤中并不相同。

表4列出了菌株Q18、菌株Q18與苜蓿已及菌株Q18與芥菜復合體系在3種不同類型土壤中5d內總的降解率。

表4 不同類型土壤中5d內柴油總降解率 (%)

由表4可以清楚看出，5d內，菌株Q18對柴油的降解率在砂壤土中最高，達到46.28%，其次為砂土，在粘土中降解率最低，大小順序為砂壤土＞砂土＞粘土。菌株Q18與芥菜復合體系對柴油降解也表現出同樣的規律，對柴油的降解率也是在砂壤土中最高 (69.17%)，然后依次為砂土，粘土。但是菌株Q18與苜蓿復合體系則不同，其對柴油的降解率是在砂土中最高，達到65．05%，其次為砂壤土，粘土中最低。可見，不同的土壤類型，對柴油的降解是有顯著影響的，而且在不同類型的土壤中，植物苜蓿和芥菜強化菌株Q18降解柴油的能力也是不同的。在砂土中，苜蓿強化菌株Q18降解柴油的能力強于芥菜;在砂壤土和黏土中，芥菜強化菌株Q18降解柴油的能力強于苜蓿。由于苜蓿和芥菜生長的差異，根際環境也不同，因此可能是植物不同的生長特性導致了苜蓿和芥菜活化菌株Q18的差異，造成了降解柴油的能力的差異。

另外，在粘土中，菌株以及菌株植物的復合體系對柴油降解率普遍都低于在砂土和砂壤土中的降解率。原因可能是由于砂土及砂壤土具有良好的孔隙度，通透性好，表面積也較大，適宜菌株和植物生長，而孔隙小、易板結的粘土環境可能并不適宜于菌株及植物的生長的緣故。

總體而言，在不同類型土壤中，植物苜蓿和芥菜都表現出很強的強化菌株降解柴油的能力。在本實驗條件下，菌株Q18與芥菜復合體系在砂壤土中降解柴油能力最強，菌株Q18與苜蓿復合體在砂土中降解柴油能力次之。

總之，不同類型的土壤對柴油微生物降解的影響顯著，這對于今后開展油污染土壤現場修復具有重要意義。同時，復合植物條件下的微生物降解也為污染土壤修復提供了新的思路。

3 結論

(1)菌株Q18對土壤中柴油具有較強的降解能力，而且植物苜蓿和芥菜都能顯著強化菌株Q18對柴油的降解。

(2)不同的土壤類型，能影響菌株Q18對柴油的降解，菌株Q18對柴油的降解率在砂壤土中最高，達到46.28%，其次為砂土，在粘土中降解率最低。

(3)植物苜蓿和芥菜強化菌株Q18降解柴油的能力也受不同土壤類型的影響，在砂土中，苜蓿強化菌株Q18降解柴油的能力強于芥菜;而在砂壤土和粘土中，芥菜強化菌株Q18降解柴油的能力強于苜蓿。總體而言，菌株Q18與芥菜復合體在砂壤土中降解柴油能力最強，菌株Q18與苜蓿復合體在砂土中降解柴油能力次之。

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