血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus SYBC-L7)色素的提取及其理化性質

駱守鵬， 范晶晶， 毛飛君， 蔡宇杰， 廖祥儒*

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.金坤生物工程有限公司，江蘇 無錫214131）

隨著生活水平和科學技術的發展，色素逐漸進入人們的視野，其不僅廣泛應用于食品行業[1]，同時還應用于醫藥[2]、化妝品[3]、印染[4]等諸多領域以滿足人們的需求。通常可將色素分為人工合成色素和天然色素兩大類[5]。近年來發現，相當一部分合成色素存在人體致癌等潛在危害，被禁止使用；相反，天然色素由于其安全可靠，色澤自然鮮艷，且具有很高的營養價值和藥理等功能，倍受人們的青睞，有取代合成色素的趨勢[6]。

天然色素來自于動植物材料和微生物，前者由于受到諸多因素，如氣候、季節等的影響，原料不足，使其應用受到局限；而利用微生物資源生產天然色素，不僅能克服前者的諸多缺點，并易于工業化[7]，逐漸成為天然色素來源的研究熱點。產天然色素的微生物資源十分豐富，已經發現可以產天然色素的微生物，主要包括原核生物、細菌、酵母、真菌、淡水藻類等[7]。然而，現階段的產天然色素研究主要集中于實驗室規模，真正實現工業化的屈指可數。

真菌作為微生物資源的一種，由于在其生長代謝過程中會合成一定的真菌色素[8-9]，近年來備受研究者關注。根據色素化合物的基本母核差異，可將真菌色素劃分為醌類、酸類、酮類和含氮化合物4類[6]，如紅曲霉屬發酵產生的紅曲色素（分為紅色和黃色），屬聚酮類化合物[10]，而竹黃菌色素主要是苝醌類化合物[11]，這兩種色素均可用于食品的著色且具有一定的藥理功能。作者利用一株血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus SYBC-L7）采用木屑、稻草秸稈、麥秸稈、水葫蘆和甘蔗渣等農業廢棄物固態發酵產色素，并對色素的提取條件及理化性質進行初步研究，探索了該類微生物在資源化利用農業廢棄物的應用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 血紅密孔菌 （Pycnoporus sanguineus SYBC-L7）為作者所在實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑 葡萄糖、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、丙酮、乙醇、甲醇等試劑：均為國產分析純；木屑：購于當地超市；稻草秸稈、麥秸稈、水葫蘆和甘蔗渣：均為作者所在實驗室提供。

1.1.3 培養基

1）PDA固體培養基 （組分g/L）：去皮土豆200，葡萄糖20，瓊脂20。保藏斜面為PDA固體培養基。

2）種子培養基（組分 g/L）：葡萄糖 30，蛋白胨5，酵母膏 10。

3）固態發酵產色素培養基：250 mL錐形瓶中加入3 g木屑（或水葫蘆、稻草秸稈、甘蔗渣、麥秸稈），加入4.5 mL營養液。營養液配方（g/L）：葡萄糖30，酒石酸銨 15，硫酸銅 0.04，磷酸二氫鉀 1，硫酸鎂0.5，磷酸氫二鈉0.2，硫酸錳0.034。種子培養基滅菌條件為115℃滅菌20 min；而其他所有培養基為121℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 固態發酵產色素 用無菌生理鹽水將P.sanguineus SYBC-L7在30℃下培養7 d的PDA平板洗滌，過濾之后即為孢子液。將孢子液接種到種子培養基（50 mL/250 mL三角瓶），30℃下旋轉式搖床200 r/min培養24 h，接種5 mL種子液至固態發酵培養基中，在30℃恒溫培養箱中培養12 d。發酵結束后，將培養基于60℃下烘干至恒重并放入干燥器內待用。

1.2.2 色素提取條件的研究

1）色素提取溶劑的選擇及測定條件的確定：取發酵干基0.2 g，加入20 mL甲醇，在20℃、100 r/min的水浴振蕩器中浸泡1 h，過濾并定容至25 mL，進行波長掃描，確定所存在的吸收峰。分別選擇甲醇、乙醇、石油醚（30~60℃）、異丙醇、異丁醇，提取色素，在最大吸收波長下檢測提取液吸光值，確定最適提取溶劑。

2）提取溫度對色素提取的影響：取發酵干基0.2 g，加入20 mL甲醇，分別置于不同溫度的水浴振蕩器中，100 r/min下浸泡1 h，取出過濾并定容至25 mL，在430 nm處測定吸光值。

3）提取轉速對色素提取的影響：取發酵干基0.2 g，加入20 mL甲醇，置于35℃水浴振蕩器中，設定不同的轉速，浸泡1 h，取出過濾并定容至25 mL，在430 nm處測定吸光值。

4）提取時間對色素提取的影響：取發酵干基0.2 g，加入20 mL甲醇，置于35℃水浴振蕩器中，分別浸泡 20、40、60、80、100、120 min，過濾并定容至25 mL，在430 nm處測定吸光值。

5）提取料液比對色素提取的影響：取發酵干基0.2 g，加入不同體積的甲醇（10、15、20、25、30 mL），并置于35℃水浴振蕩器中，提取40 min，過濾后測定樣品提取液的體積V及其在430 nm處吸光值A，并按照公式（1）計算總吸光度∑A。

1.2.3 色素的理化性質

1）色素的顯色反應：對色素提取液進行不同的化學試劑處理，觀察色素溶液顏色變化。取3 mL色素提取液，分別加入0.1 mL質量分數1%的硝酸鋁、醋酸鉛、氯化鈷、氯化亞鐵、硼酸、氫氧化鈉、氨水，混合放置10 min觀察顏色變化。

2）色素穩定性研究

熱穩定性：取5 mL色素提取液，分別置于20、30、40、50、60、70 ℃的水浴鍋中加熱 2 h， 冷卻至室溫后測定430 nm處吸光值。

pH穩定性：取5 mL色素提取液，用1 mol/L的HCl或 NaOH 調節其 pH 值為 1、3、5、7、9、11、13，放置30 min后測定430 nm處吸光值并觀察顏色變化。

氧化劑與還原劑的影響：配制不同濃度梯度的NaHSO3、H2O2、 維生素 C、K2CrO7溶液， 分別取 0.5 mL加入到2.5 mL色素提取液中，放置30 min后測定430 nm處吸光值并觀察顏色變化。

2 結果與討論

2.1 固態發酵產色素及色素的提取

為了探究菌株P.sanguineus SYBC-L7在不同農業廢棄物固態發酵時生長和產色素的情況，選擇稻草秸稈、麥秸稈、水葫蘆、甘蔗渣和木屑5種廢棄物作為固態基質進行發酵，結果見表1。

表1 P.sanguineus SYBC-L7在不同基質下的生長和產色素情況Table 1 Growth and pigment production by P.sanguineus SYBC-L7 in different solid substrate

實驗中觀察菌株菌絲的生長情況，發現菌株在水葫蘆和稻草秸稈下，菌株生長緩慢，這可能是因為水葫蘆和稻草中營養物質較少，進而影響了菌株的生長。在甘蔗渣中，菌株生長良好但僅有少量色素產生；而在麥秸稈和木屑中菌絲生長較好，均明顯有色素產生，且后者產量高于前者，因此后期將選擇木屑作為發酵固體的介質，進一步優化其發酵條件。

菌株 P.sanguineus SYBC-L7在木屑的固態基質下生長較好，且在培養過程中培養物表面有一類橘紅色物質產生，見圖1a。將甲醇加入到烘干的固態培養物中，可較好地提取其中橘紅色色素，所得溶液呈黃色，見圖1b。

圖1 菌株P.sanguineus SYBC-L7在固態基質下產色素及色素甲醇提取液Fig.1 Pigment produced by P.sanguineus SYBC-L7 in solid state fermentation and its methanol extraction solution

圖2為色素提取液的波長掃描圖譜，從圖2可知，發酵后提取液在可見光區存在明顯的吸收峰，波長范圍為430~450 nm，該結果與圖1b結果相吻合；且其最大吸收波長為430 nm，因此選取430 nm作為后期檢測該色素的波長。

圖2 色素提取液波長掃描圖譜Fig.2 Wavelength scanning of methanol extraction

2.2 色素的提取的優化

2.2.1 提取溶劑的選擇 表2為不同溶劑提取固體發酵基質后的色素提取液在430 nm處吸光值。可知，使用石油醚（30~60℃）為提取劑時吸光值低，表明基本無色素被提取，而異丙醇和異丁醇吸光值較小；甲醇提取液吸光值最大，提取能力最好，乙醇次之，因此后續實驗選擇甲醇作為提取溶劑。

表2 提取溶劑對色素提取效果的影響Table 2 Effect of different solvents on the extraction of pigment

2.2.2 提取溫度對色素提取的影響 在不同的溫度下，色素的溶解度有所差異，最終會影響色素提取效率。圖3為不同溫度下的色素提取結果，在15~35℃范圍內，隨著溫度的增加，色素吸光值明顯增加，且在35℃達到最高值，隨后略有所下降。綜合考慮到節能方面，選擇35℃為最適提取溫度。

圖3 提取溫度對色素提取的影響Fig.3 Effect of temperature on the extraction of pigment

2.2.3 轉速對色素提取的影響 從圖4可以看出，在不同轉速下，色素提取液在430 nm處吸光值差異不顯著，表明轉速對于色素提取影響不大。綜合考慮，提取轉速定為50 r/min，以便較好的提取色素。

2.2.4 提取時間對色素提取的影響 在色素的提取過程中，提取時間是一個很重要的指標，縮短提取時間能提高提取效率。圖5為不同提取時間色素提取的結果。可知，提取40 min時提取液吸光值最高，且延長時間吸光值變化不大，表明在40min時候能夠較好的提取色素，因此選40min為最適提取時間。

圖4 提取轉速對色素提取的影響Fig.4 Effect of rotating speed on the extraction of pigment

圖5 提取時間對色素提取的影響Fig.5 Effect of time on the extraction of pigment

2.2.5 料液比對色素提取的影響 圖6為不同料液比對色素提取液總吸光值∑A的結果，在0.2：10時色素總吸光值較低，而在0.2：15時較高；而繼續減小料液比時，色素總吸光值變化不明顯，因此選擇0.2∶15的料液比進行色素提取。

圖6 料液比對色素提取的影響Fig.6 Effect of material to liquid ratio on the extraction of pigment

2.3 色素的理化性質

2.3.1 色素提取液的顯色反應 由于多數天然產物含有特殊基團，能夠在不同的處理溶液條件下呈現特定的反應變化[12]。由表3可知，醋酸鉛溶液處理會產生黃色沉淀，而其他處理均無沉淀產生，可能是由于色素化合物含有羥基和羰基結構，能與醋酸鉛形成絡合物；氫氧化鈉和氨水處理后，提取液顏色變成淺土色，可能是由于溶液的pH值呈堿性導致。

表3 化合物處理對色素顏色的影響Table 3 Effect of chemical compound on the pigment

2.3.2 溫度對色素穩定性的影響 從圖7可知，在20~60℃范圍內，吸光值無明顯變化，表明該色素在所選擇的溫度范圍內穩定性較好，具有較強的耐熱性。

圖7 溫度對色素穩定性的影響Fig.7 Effect of temperature on stability of pigment

2.3.3 pH對色素穩定性的影響 pH值對天然色素的影響主要是使天然色素的結構或組成發生變化，從而使其顏色產生變化[13]。色素提取液的pH穩定性結果見表4。由表4可知，色素在酸性條件下較為穩定，呈黃色；而當pH為堿性時，色素吸光值降低，且顏色逐漸變淺，呈黃灰色。

2.3.4 氧化劑與還原劑對色素穩定性的影響 由圖8可知，加入不同濃度的NaHSO3、H2O2溶液的吸光度沒有明顯的變化，且溶液顏色基本無變化；而加入VC之后，溶液的吸光值有所下降，且溶液的顏色逐漸變淺，可能是因為色素能與VC發生某種反應，從而導致溶液顏色變淺且吸光值下降。但K2CrO7加入之后，溶液迅速變色且出現紅色沉淀，這可能是因K2CrO7氧化性太強，色素直接被氧化形成沉淀。

表4 pH值對色素穩定性的影響Table 4 Effect of pH on stability of pigment

圖8 氧化劑與還原劑的濃度對色素的影響Fig.8 Effect of oxidizer and reducing agents on pigment stability

3 結語

通過微生物發酵技術，可將農業固體廢棄物作為發酵培養基原料，在合理處置農業固體廢棄物的同時，也可產生一些高附加值的生物活性物質如生物酶、天然色素等。血紅密孔菌是自然界中廣泛存在的一類白腐真菌，其在生長過程中會產生一類紅色的色素，有報道稱血紅密孔菌的色素具有一定的抑制細菌生長的作用[14]，可作為功能性的天然色素使用，因此研究這類真菌發酵產色素的條件及色素的提取條件和色素的理化性質具有一定的理論和應用價值。

作者研究了血紅密孔菌Pycnoporus sanguineus SYBC-L7固態發酵產色素的條件，發現菌株在木屑固態培養下菌株產色素較好。在35℃水浴條件下，使用甲醇浸泡40 min可較好的提取固體發酵后的色素；同時，該色素具有較好的熱穩定性和耐酸性，常用的氧化劑與還原劑對其影響不大，初步認定其為一種穩定性較好的天然色素。后續實驗將重點研究色素的分離純化條件，確定色素的組成成分、分子組成、分子結構等，以進一步了解血紅密孔菌色素的性質，從而實現其產業化應用。

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