基于關(guān)鍵因素調(diào)控發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)氧化氫酶

周麗萍 ， 劉 龍 ， 李江華 ， 堵國(guó)成 *， 陳 堅(jiān)

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

過(guò)氧化氫酶（Catalase，簡(jiǎn)稱 CAT，EC 1.11.1.6）是紅細(xì)胞的衍生物，它可催化過(guò)氧化氫分解為水和氧氣，使過(guò)氧化氫不至于與超氧化物自由基反應(yīng)生成有害的·OH[1-2]。CAT對(duì)血紅蛋白及其它的含巰基蛋白質(zhì)起到保護(hù)作用，使它們不被氧化，因此對(duì)減輕活性氧損傷有一定意義[1-3]。單功能CAT來(lái)源最為廣泛，但其結(jié)構(gòu)都基本相同。它由4個(gè)相同亞基組成四聚體，每個(gè)亞基都有相同的多肽以1個(gè)血紅素或鐵離子作為活性中心，該活性中心的一分子鐵卟啉帶有4個(gè)鐵原子，因此相對(duì)分子質(zhì)量一般較大，為200 000~340 000[4]。由于CAT高效催化特性，其已經(jīng)廣泛應(yīng)用于紡織棉織物前處理、醫(yī)學(xué)診斷、食品處理、造紙制漿、美容、臨床、塑料、橡膠、纖維等領(lǐng)域[5-7]。

CAT存在于絕大多數(shù)好氧生物和一部分厭氧生物中。CAT也普遍存在于植物中，但不包括真菌，雖然已發(fā)現(xiàn)有些真菌在低pH值和溫暖的環(huán)境下能夠產(chǎn)生該酶。動(dòng)物CAT存在于已知?jiǎng)游锏母鱾€(gè)組織中，尤以肝與紅細(xì)胞為最多。動(dòng)物肝臟是CAT的一個(gè)很大來(lái)源，國(guó)內(nèi)外均已實(shí)現(xiàn)這一產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)[3，8-10]。微生物來(lái)源的CAT是目前研究的熱點(diǎn)。國(guó)外繼黑曲霉和微溶壁球菌產(chǎn)CAT分別實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生之后，又開(kāi)發(fā)了產(chǎn)酶性能更佳的嗜熱子囊菌、芽孢桿菌、重組大腸桿菌等微生物菌種[3]。國(guó)內(nèi)用微生物生產(chǎn)CAT主要還停留在研究開(kāi)發(fā)階段。現(xiàn)在市售商品過(guò)氧化氫酶基本為牛肝過(guò)氧化氫酶和微生物產(chǎn)過(guò)氧化氫酶共存，微生物生產(chǎn)CAT基本由諾維信、有田酵素、杰能科等個(gè)別大公司控制。

本研究室前期已利用PCR擴(kuò)增技術(shù)得到枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）過(guò)氧化氫酶基因 katA，將該基因與表達(dá)載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21高效表達(dá)。初步優(yōu)化后，搖瓶產(chǎn)酶水平達(dá)到20 000 U/mL。研究中發(fā)現(xiàn)，要實(shí)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶的工業(yè)化生產(chǎn)，存在的問(wèn)題主要是酶表達(dá)量仍相對(duì)較低。

作者采用系統(tǒng)發(fā)酵優(yōu)化策略，對(duì)構(gòu)建好的重組E.coli進(jìn)行CAT發(fā)酵產(chǎn)酶研究，確定了影響重組菌產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素及其含量。為了進(jìn)一步提高CAT的表達(dá)量，在已確定關(guān)鍵因素的基礎(chǔ)上，采用不同甘油流加策略在3 L發(fā)酵罐上進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化研究，確定了最適產(chǎn)酶補(bǔ)料策略，這為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）WSHDZ-01[11]：由武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M206062。已構(gòu)建產(chǎn)酶重組大腸桿菌基因工程菌 E.coli BL21 （DE3）（pET-20b（+）-katA）宿主：為作者所在研究室構(gòu)建并保存[3]。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng) 從-80℃保藏甘油管中接100 μL至25 mL/250 mL的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。接種前于LB中添加100 μg/mL的氨芐青霉素（Amp）。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將活化的重組大腸桿菌LB種子液以體積分?jǐn)?shù)3%接入裝有30 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)36 h。

1.2.3 3 L發(fā)酵罐培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的重組大腸桿菌種子液以體積分?jǐn)?shù)3%接入裝液量為1.5 L的3 L NBS發(fā)酵罐中，起始攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，通氣量1 vvm，溫度為37℃，誘導(dǎo)溫度為30℃，pH 7.5。其他發(fā)酵條件視優(yōu)化條件改變。

1.3 酶液制備

取所需量的發(fā)酵液4℃、10 000 r/min離心5 min，上清液即為胞外過(guò)氧化氫酶液樣品；菌體以K2HPO4-KH2PO2（pH 7.0）緩沖液洗滌后，于 4 ℃、10 000 r/min離心5 min，棄上清液，再以適量上述緩沖液重懸菌體后放置于冰浴；超聲波間歇破碎10 min后4℃、10 000 r/min離心5 min，上清液即胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶液待測(cè)樣品[12-13]。

1.4 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定

采用分光光度法于37℃測(cè)定酶活。反應(yīng)體系為3 mL，將0.1 mL待測(cè)酶液樣品快速加入2.9 mL含10 mmol/L H2O2的50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液（pH 7.0）中，用UV-2450型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)于240 nm處測(cè)定H2O2的分解速率。酶活定義為：37℃下，每分鐘分解1 μmol H2O2所需的酶量為一個(gè)酶活單位[14]。

1.5 菌體濃度測(cè)定

取一定量的發(fā)酵液稀釋后，用分光光度計(jì)測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)下的OD600值。

1.6 甘油質(zhì)量濃度測(cè)定

采用安捷倫1100高效液相色譜（HPLC）。色譜條件為流動(dòng)相：5 mmol/L H2SO4（275 μL 濃 H2SO4定容至 1 L），流速：0.6 mL/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化搖瓶發(fā)酵條件

酶的生物合成受到多種因素共同制約，同時(shí)各種因素、條件等對(duì)酶合成的影響大小也是不一樣的，因此需要對(duì)各種因素的影響進(jìn)行綜合考察。本研究采用正交試驗(yàn)對(duì)影響CAT合成的幾個(gè)主要因素進(jìn)行考察，從中分析出主次因素以及各個(gè)因素對(duì)CAT合成的影響規(guī)律，從而找出重組E.coli BL21（DE3）（pET-20b（+）/katA）胞外 CAT 合成的關(guān)鍵因素[15]。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)考察的結(jié)果[3]，選擇碳源-甘油，氮源-安琪酵母粉，誘導(dǎo)溫度，pH四種因素作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素，每個(gè)因素選擇三個(gè)水平，進(jìn)行了四因素三水平的正交試驗(yàn)。表1是正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表，表2是正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表。根據(jù)極差直觀分析，得到了各因素對(duì)胞外CAT合成的影響大小。如表3所示，各個(gè)因素影響CAT合成的主次順序?yàn)椋赫T導(dǎo)溫度＞甘油＞安琪酵母粉＞pH，即溫度的影響最大，其次是甘油和安琪酵母粉，最后是pH。在此基礎(chǔ)上，為了獲得CAT的較高合成水平，根據(jù)各因素各水平的平均值確定最優(yōu)水平，進(jìn)而選出最優(yōu)組合。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels for the orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表Table 2 Intuitive analysis table of the orthogonal test

表3 各因素影響CAT合成的相對(duì)重要性及最優(yōu)水平選擇Table 3 Relative importance of various factors and the optimal level for CAT activity

分析結(jié)果表明，在所選的幾種因素中，溫度是影響重組E.coli發(fā)酵生產(chǎn)CAT的最主要因素。據(jù)報(bào)道，誘導(dǎo)溫度是重組E.coli發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白的重要因素之一[16-17]。溫度過(guò)高時(shí)常會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性降低，對(duì)重組蛋白的表達(dá)具有負(fù)面效應(yīng)[18]。Fang等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)溫度由30℃增加至37℃時(shí)，重組E.coli生產(chǎn)堿性果膠酶的產(chǎn)量急劇下降[18]。pH對(duì)產(chǎn)酶的影響相對(duì)較小，綜合考慮菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶等因素取最適初始pH 7.5。依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，確定CAT合成的的最優(yōu)搖瓶發(fā)酵條件為：甘油5 g/L、安琪酵母粉35 g/L、初始pH 7.5、誘導(dǎo)溫度為30℃。經(jīng)搖瓶驗(yàn)證結(jié)果顯示胞外CAT活性達(dá)到24 152.7 U/mL，與優(yōu)化前（20 000 U/mL）相比，CAT 產(chǎn)酶量顯著提高。

2.2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)重組E.coli發(fā)酵生產(chǎn)CAT的影響

采用搖瓶?jī)?yōu)化得出的最佳條件進(jìn)行罐上實(shí)驗(yàn)，主要考察了攪拌轉(zhuǎn)速、流加策略等因素對(duì)罐上發(fā)酵生產(chǎn)CAT的影響。從搖瓶放大到發(fā)酵罐放大過(guò)程中，往往會(huì)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程偏差較大的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)主要原因就是在于溶解氧、攪拌剪切力等的變化[19]。發(fā)酵過(guò)程對(duì)于溶氧的需求并不是越大越好，有研究表明，高溶氧可能會(huì)抑制重組E.coli發(fā)酵過(guò)程中一些產(chǎn)物的生成。Petruccioli研究發(fā)現(xiàn)，適中的攪拌轉(zhuǎn)速有利于CAT的發(fā)酵生產(chǎn)[20]。

發(fā)酵罐中的溶解氧主要可以通過(guò)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量來(lái)調(diào)節(jié)。攪拌的作用是打散氣泡的作用，提高發(fā)酵液中溶氧量，使罐內(nèi)溶液在發(fā)酵過(guò)程中充分混勻。適當(dāng)增大通氣量結(jié)合攪拌的作用，可以更有利促進(jìn)氧的流通及傳遞。本研究在通氣量為1 vvm的前提下，不同攪拌轉(zhuǎn)速（300、400、450 r/min）下發(fā)酵過(guò)程參數(shù)變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。在轉(zhuǎn)速?gòu)?00~450 r/min的變化過(guò)程中，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增大，發(fā)酵前12小時(shí)（對(duì)數(shù)期）菌體生長(zhǎng)速度大大增加，之后進(jìn)入穩(wěn)定期菌體量基本恒定。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)，菌體生長(zhǎng)迅速，約26 h后最大OD600值達(dá)到42.5（圖1a）。不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)重組E.coli菌體生長(zhǎng)具有重要意義，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，最大比生長(zhǎng)速率逐漸增加（圖1b）。在450 r/min時(shí)，比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大，最大值為1.5 h-1。CAT發(fā)酵產(chǎn)酶酶活隨著轉(zhuǎn)速增大急劇減少，轉(zhuǎn)速為300 r/min時(shí)，酶活力最高，為20 117.2 U/mL（圖1c）。不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)重組E.coli發(fā)酵生產(chǎn)CAT的生成速率具有重要影響。如圖1d所示，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的不斷降低，CAT酶的比生成速率逐漸增加，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min時(shí)，酶的比生成速率達(dá)到最大， 為 71.7 U/（mL·h·OD600）。由此可知，增大攪拌轉(zhuǎn)速能很好的促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，然而卻抑制了產(chǎn)物CAT的發(fā)酵生產(chǎn)。結(jié)果表明，較低的轉(zhuǎn)速有利于目的產(chǎn)物CAT的生成，因此選擇300 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。

2.3 不同初始甘油質(zhì)量濃度對(duì)重組菌發(fā)酵生產(chǎn)CAT的影響

在重組E.coli發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白過(guò)程中，培養(yǎng)基中的碳氮比直接影響產(chǎn)物合成及細(xì)胞增殖。這就需要調(diào)節(jié)好初始碳源質(zhì)量濃度，太低將會(huì)使發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)不足、菌體生長(zhǎng)受限，太高又會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成底物抑制效應(yīng)。不同初始甘油質(zhì)量濃度條件下，細(xì)胞對(duì)甘油的消耗及自身生長(zhǎng)代謝情況也會(huì)不同。研究表明，初始甘油質(zhì)量濃度對(duì)E.coli發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白具有重要作用[18]。為此，作者考察了不同初始甘油質(zhì)量濃度下重組E.coli生長(zhǎng)及生產(chǎn)重組CAT的情況變化。

圖1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)重組E.coli發(fā)酵生產(chǎn)CAT的影響Fig.1 Effectofdifferentstirring speech on CAT production in recombinant E.coli

雖然前面搖瓶?jī)?yōu)化得出的最佳甘油質(zhì)量濃度為5 g/L，但是經(jīng)過(guò)罐上放大，通氣量、轉(zhuǎn)速的作用效果都會(huì)使菌體比搖瓶更快速生長(zhǎng)，考慮到5 g/L的甘油可能不夠消耗，因此實(shí)驗(yàn)選取了10、15、20、30 g/L進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同初始甘油質(zhì)量濃度下的發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.2 Curve of fermentation process under different initial glycerol concentrations

由圖2（a）可知，在考察的甘油質(zhì)量濃度范圍內(nèi)菌體細(xì)胞均能較好的生長(zhǎng)，生長(zhǎng)趨勢(shì)及所能達(dá)到的最大OD600值都相差不大，但是到發(fā)酵后期初始甘油質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)的菌體生長(zhǎng)有略微下降，可能原因是后期甘油耗盡，不能繼續(xù)維持細(xì)胞生長(zhǎng)。由圖2（b）可見(jiàn)，隨著甘油初始質(zhì)量濃度的增大，工程菌的CAT胞外酶活有增大趨勢(shì)，然而周期也隨之延長(zhǎng)，這在工業(yè)化中是不可取的。在初始甘油質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，最大酶活與其他初始甘油質(zhì)量濃度有所偏差，但是發(fā)酵及產(chǎn)酶周期卻是最短的。由圖2（c）可知，發(fā)酵液種甘油質(zhì)量濃度隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行而下降。因此，綜合考慮CAT產(chǎn)量、發(fā)酵周期以及工業(yè)化生產(chǎn)成本等因素，采用10 g/L的甘油作為初始質(zhì)量濃度，可以更經(jīng)濟(jì)地得到較理想的酶產(chǎn)量。另外，也可以考慮在甘油初始質(zhì)量濃度較低情況下，可以通過(guò)發(fā)酵過(guò)程的補(bǔ)料來(lái)達(dá)到更好的高產(chǎn)效果。

2.4 恒速流加甘油對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

通過(guò)前面的研究發(fā)現(xiàn)，菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶并不是成正比的，需要找到一個(gè)適宜的條件使得菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶得到協(xié)調(diào)增長(zhǎng)。由2.3得出最適的初始甘油添加質(zhì)量濃度為10 g/L，在此基礎(chǔ)上在誘導(dǎo)后開(kāi)始恒速流加甘油，根據(jù)發(fā)酵對(duì)數(shù)后期甘油的消耗速率，擬選擇 0.67 g/（L·h）的速率流加甘油 25 h（發(fā)酵過(guò)程因取樣、蒸發(fā)、流加等因素造成發(fā)酵液體積變化忽略），結(jié)果見(jiàn)圖3。如圖3a所示，甘油的恒速流加不能對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生促進(jìn)作用，隨著甘油的不斷流加，重組菌的菌體濃度逐漸降低。通過(guò)對(duì)CAT酶酶活的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，甘油流加可以促進(jìn)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，最高酶活為28 243.0 U/mL。如圖3b所示，甘油的流加對(duì)菌體比生長(zhǎng)速率幾乎沒(méi)有促進(jìn)作用。但甘油的流加能促進(jìn)CAT酶產(chǎn)量的提高，但同時(shí)也抑制了前期酶的生產(chǎn)，在發(fā)酵后期CAT開(kāi)始快速生產(chǎn)。

圖3 甘油恒速流加對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of constant glycerol feeding on cell growth and CAT production

2.5 一次性補(bǔ)加甘油策略的猜想及驗(yàn)證

由上述結(jié)論可知，甘油恒速流加不利于此重組E.coli工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)CAT，而后期酶活的劇增說(shuō)明，加快甘油的補(bǔ)料速率或者一次性補(bǔ)入碳源是否也能起到提高酶產(chǎn)量的效果。因此，在誘導(dǎo)開(kāi)始時(shí)一次性補(bǔ)入上述恒速流加等量的甘油，即16.7 g/L，進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程參數(shù)（酶活、OD600、菌濃）的測(cè)定與分析，見(jiàn)圖4。如圖4（a）所示，在誘導(dǎo)時(shí)一次性補(bǔ)加甘油，OD600迅速上升，最大值為27.9。當(dāng)發(fā)酵至47 h時(shí)，CAT酶活達(dá)到最大值為50 369.5 U/mL，為優(yōu)化前酶產(chǎn)量的2.5倍。如圖4（b）所示，在誘導(dǎo)開(kāi)始時(shí)采用一次性補(bǔ)料策略，可以使產(chǎn)酶的最大比生成速率出現(xiàn)的時(shí)間提前，有利于酶的快速高效生產(chǎn)。

圖4 甘油補(bǔ)料對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Fig.4 Glycerol feeding on cell growth and CAT production

3 結(jié)語(yǔ)

本研究采用正交試驗(yàn)策略，系統(tǒng)分析了不同關(guān)鍵因素對(duì)重組E.coli發(fā)酵生產(chǎn)CAT的影響，確定了4種不同關(guān)鍵因素對(duì)產(chǎn)酶的影響次序。同時(shí)，確定CAT合成的最優(yōu)搖瓶發(fā)酵條件為：甘油5 g/L、安琪酵母粉35 g/L、初始pH 7.5、誘導(dǎo)溫度為30℃。攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶具有重要影響，當(dāng)轉(zhuǎn)速為300 r/min時(shí)，酶活力最高為20 117.2 U/mL。在3 L發(fā)酵罐上發(fā)酵生產(chǎn)CAT時(shí)，在初始甘油質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)發(fā)酵與產(chǎn)酶周期最短，最適合發(fā)酵產(chǎn)酶。甘油的流加能促進(jìn)CAT酶產(chǎn)量的提高，以0.67 g/（L·h）的速率流加甘油，最高酶活為28 243.0 U/mL。然而，在誘導(dǎo)開(kāi)始時(shí)一次性補(bǔ)入上述恒速流加等量的甘油，當(dāng)發(fā)酵至47 h時(shí)，CAT酶活達(dá)到最大值為50 369.5 U/mL，為優(yōu)化前酶產(chǎn)量的2.5倍。

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