白癜風維生素D受體Apa I基因多態(tài)性及其與免疫異常的關系

韋海鵬 鐘永軍 李曉華

1.北海市人民醫(yī)院皮膚科,廣西北海 536000;2.右江民族醫(yī)學院微免教研室,廣西百色 533000

臨床上,白癜風是一種以局部色素脫失形成白斑為特征的常見多發(fā)性色素性皮膚病,是一種獲得性疾病,臨床主要表現(xiàn)為皮膚色素脫失進而形成的白色的點或者斑片,大小從幾毫米到數厘米不等,其周圍為正常皮膚,隨著病情的發(fā)展,色素脫失癥狀會逐漸擴大,形成更大的皮損[1-2]。遺傳和流行病學研究發(fā)現(xiàn)[3],白癜風患者可能有一定的遺傳缺陷傾向,使黑素細胞容易被破壞,最終引起白癜風的發(fā)生。維生素D受體基因定位于12號染色體長臂1區(qū)3帶上,存在多個限制性內切酶酶切位點。研究已證實[4],維生素D受體基因與皮膚黑素細胞的數量變化有一定的關系。在此背景下,本研究即探討白癜風維生素D受體Apa I基因多態(tài)性及其與免疫異常的關系,為其臨床研究提供可參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

連續(xù)收集2011年12月—2013年1月該院皮膚科門診的白癜風患者94例作為病例組,按照中華醫(yī)學會白癜風診斷標準進行診斷,其中男性53例,女性41例,年齡8～63歲,平均年齡(28.6±8.2)歲。同時隨機選取無血緣關系的健康人群98例作為對照組,其中男性55例,女性43例,年齡8～67歲,平均年齡(28.7±8.1)歲。兩組間性別、年齡等基本資料比較差異不明顯(P＞0.05),具有臨床可比性。所有受試者均排除外傷、血液系統(tǒng)疾病、急性感染、惡性腫瘤等疾病;既往有肝腎功能不全等。納入對象均不存在血緣關系,且均簽署了知情同意書,符合醫(yī)院相關管理條例。

1.2 方法

入院后對所有受試者的基本信息及相關病史進行詳細的調查,病例組患者于入院后次日晨、對照組于參與本課題當日同一條件下抽取所有受試者的血液樣本4 mL,其中2 mL應用檢測外周血免疫球蛋白IgA、IgM、IgG等相關生化指標,另外2 mL用于提取白細胞基因組DNA。

采用PCR-RFLP技術檢測和DNA測序技術驗證維生素D受體Apa I基因多態(tài)性,所用引物均應用軟件Premier5.0自行設計,上游引物:5‘-CAACC AAGAC TACAA GTACC GCGTC AGTGA-3‘;下游引物:5‘-TGGCG GCAGC GGATG TACGT CTGC-3‘,并經GENEBANK中BLAST分析其特異性高,由上海英俊生物技術公司合成。用的限制性內切酶Apa I,總反應體系20μL,包括PCR產物1μg,10×NEB緩沖液2μL,限制性內切酶0.5μL(NEB公司),其余用滅菌雙蒸水填至20μL,65℃(75℃)溫育16h,3%瓊脂糖凝膠(溴化乙錠染色),電泳30 min,紫外線下觀察,攝影。將酶切產物與DNA片斷長度標準物比較以鑒定基因型。同時分析基因多態(tài)性與外周血免疫球蛋白IgA、IgM、IgG等相關性。

1.3 統(tǒng)計學分析

數據處理采用SPSS11.5軟件包進行。群體代表性采用Hardy-Weinberg平衡法進行檢測,計量資料及基因型、等位基因頻率的比較采用χ2檢驗,計量資料經檢驗為正態(tài)分布者,且方差齊者(均數±標準差)采用t檢驗。檢驗P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基因多態(tài)性分析

維生素D受體Apa I基因的PCR擴增產物片段長度為760bp,包含Apa I酶切片段。AA基因型(野生型)不能被酶切斷,僅見740bp1種片段;Aa基因型為雜合子,可見740bp、520bp和220bp3種片段;aa基因型(突變純合子)的擴增產物可被完全切斷,電泳可見520bp和220bp2種片段。

2.2 維生素D受體基因單位點分析

病例組、對照組基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(P＜0.05),本研究的樣本來自同一人群,兩組間基因型比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。病例組a等位基因頻率34.04%明顯高于對照組20.41%,差異比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);顯性模型結果顯示,病例組Aa+aa基因型分布頻率高于對照組,差異比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);隱形模型結果顯示,與對照組相比,病例組AA+Aa基因型分布頻率較高,但差異比較不明顯(P＞0.05)(表1,2)。

表1 維生素D受體基因基因型及等位基因的分布

表2 維生素D受體基因顯性及隱性模型分析

2.3 維生素D受體基因基因型與外周血免疫球蛋白相關性

維生素D受體基因基因型與外周血免疫球蛋白相關性結果顯示:病例組血清IgA水平明顯低于對照組血清IgA水平,兩組間差異比較有統(tǒng)計意義(P＜0.05);且Aa及aa基因型血清IgA水平亦明顯低于對照組血清IgA水平,差異比較亦有統(tǒng)計意義(P＜0.05);其余免疫球蛋白血清水平比較無明顯差異(P＞0.05),見表3。

表3 維生素D受體基因基因型與外周血免疫球蛋白相關性

3 討論

流行病學研究已證實[5],身體的任何部位均可受到白癜風的影響,一般而言,白癜風多為雙側對稱分布,我國每100個人中有1～2個人發(fā)病。其中半數在20歲以前就開始出現(xiàn)皮損,且大約1/5的人有家族史。白癜風的主要病理表現(xiàn)為白癜風皮損處完全缺乏黑素細胞及黑素顆粒,基底層多巴染色陽性的黑素細胞缺如[6]。

維生素D受體是一種可以介導1,25(OH),D發(fā)揮生物效應的親核蛋白,是類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員之一,維生素D通過與其結合可以調控相應DNA序列結構基因的表達,進而可以參與細胞的增殖、分化等方面的調節(jié)作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)[8],Apa l酶切位點位于第VIII內含子上,其多態(tài)性不影響VDR的氨基酸序列,主要通過改變基因的二級以上的結構發(fā)揮作用。

本研究探討白癜風維生素D受體Apa I基因多態(tài)性,結果顯示病例組a等位基因頻率高于對照組,同時顯性模型結果顯示,病例組Aa+aa基因型分布頻率高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義。孫越等[9]采用聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態(tài)性方法,對46例白癜風患者和50例健康人的維生素D受體Apa I基因型進行分析。結果顯示VDR-ApaI基因AA,Aa,aa基因型分布頻率在白癜風組分別為6.52%,21.74%,71.74%,對照組分別為12.00%,42.00%,46.00%。維生素D受體Apa I位點上aa基因型在白癜風患者中頻率較高(P=0.036)。且患者組a等位基因分布頻率明顯高于正常對照組(χ2=6.142,P=0.01)。

本研究進一步對Apa I基因多態(tài)性外周血免疫球蛋白的相關性進行研究,結果顯示病例組血清IgA水平明顯低于對照組血清IgA水平,且Aa及aa基因型血清IgA水平亦明顯低于對照組血清IgA水平。分析可能為Aa及aa基因型引起,其中a等位基因為主要原因。孫越等[10]采用聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態(tài)性方法,對46例白癜風患者和50例健康人的 Apa I 基因多態(tài)性進行分析,以及各基因型與外周血免疫球蛋白IgA、IgM、IgG之間的關系。結果顯示Apa I 位點的 aa 基因型在白癜風患者中出現(xiàn)的頻率高于正常對照組(P＜0.05)。Aa、aa 基因型組白癜風患者血清免疫球蛋白IgA 水平顯著低于正常對照組(P＜0.05與P＜0.01)。Ali等[11]檢測白癜風患者血清 IgG、IgA 和 IgM 的水平,與正常人相比,IgG和 IgA水平比較低,而IgM差異不明顯,進一步分析發(fā)現(xiàn)IgG 滴度與患者的白斑數目存在密切的相關性,因此血清免疫球蛋白可能參與了白癜風的發(fā)病。

近年來研究發(fā)現(xiàn)[12-13],白癜風患者血清中存在抗黑素細胞自身抗體,并且抗體滴度與疾病的面積和活動性存在密切的相關性。其發(fā)生機制目前認為是,自身抗體可以通過與黑素細胞膜抗原相結合進而可以發(fā)揮補體的溶解作用對黑素細胞進行破壞[14]。亦有研究發(fā)現(xiàn)[15],白癜風患者皮膚中殘存的凋亡分子Apaf-1可以誘導IgG 在體外促進黑素細胞的凋亡。

綜上所述,本研究提示,維生素D受體Apa I基因多態(tài)性與白癜風的發(fā)生存在密切的相關性,其可能通過影響機體的免疫功能,特別是血清IgA水平發(fā)揮作用。

[1]閔一果,黃永華.維生素D3類似物治療白癜風分子生物學機制及臨床應用現(xiàn)狀[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2012,9(24):162-164.

[2]邱夢桃,余鵬,陳文靜,等.采用微衛(wèi)星標記法對白癜風易感基因的初步篩查研究[J].皮膚性病診療學雜志,2011,18(4):234-236.

[3]張建青,李建軍.白癜風的表觀遺傳學研究進展[J].皮膚性病診療學雜志,2012,17(5):384-386.

[5]張好勤,王培光,胡大雁,等.ZMI Z1區(qū)域單核苷酸多態(tài)性rs11593576與漢族人白癜風臨床表型的相關性研究[J].安徽醫(yī)科大學學報,2011,6(9):934-937.

[6]郭睿,郝雁杰,汪京峽,等.VDR基因多態(tài)性與寧夏回漢族白癜風患者的相關性研究[J].中國實驗診斷學,2012,16(12):2223-2226.

[9]孫越,韓菁,吳瑞勤,等.白癜風患者維生素D受體Apa I,BsmI,Fok I基因多態(tài)性分析[J].中國皮膚性病學雜志,2009,23(11):695-698.

[10]孫越,韓菁,吳瑞勤,等.白癜風患者維生素D受體Apa I基因多態(tài)性及免疫異常的研究[J].中國中西醫(yī)結合皮膚性病學雜志,2011,10(3):148-151.