纈沙坦的血藥濃度測定

郭影坤， 隋 陽

（東北制藥集團供銷有限公司， 遼寧 沈陽 110023）

纈沙坦是一種非肽類的血管緊張素 II 受體AT1拮抗劑，選擇性作用于AT1受體亞型，從而阻斷血管緊張素II介導的生理效應。纈沙坦對血管緊張素轉化酶（ACE）沒有抑制作用，不引起緩激肽和 P物質的儲留，因而不引起咳嗽等不良反應[1]。纈沙坦能擴張血管，改善心室及血管的重塑，抑制醛固酮，保鉀排鈉，從而達到降壓作用。纈沙坦用于治療各類輕至中度高血壓，尤其適用腎臟損害所致繼發性高血壓。此外，纈沙坦還可顯著減少尿蛋白排出量，對慢性腎小球腎炎病人有益[2]。有關纈沙坦濃度測定的高效液相色譜法國內外都有報道[3-10]，本實驗建立了一種高效液相色譜法測定纈沙坦血漿濃度, 在國內外文獻的基礎上改進了血樣預處理方法, 重新選擇了內標物, 優化了流動相的組成, 采用液-液萃取法進行血漿預處理，具有方法簡便, 回收率高, 重復性好的優點,能夠靈敏、快速檢測人血漿中纈沙坦的濃度，可用于纈沙坦的體內分析及臨床藥學研究，為人體藥代動力學研究提供了測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀 器

SHIMADZU LC10-AT系列高效液相色譜儀、HY-4調速多用振蕩器、XW-80A旋渦混合器、電熱恒溫水浴鍋、WM-2A型無油氣體壓縮機、LD4-2A低速離心機。

1.2 藥品與試劑

代文（纈沙坦膠囊），規格：80 mg/粒，北京諾華制藥有限公司生產，批號：X0372，有效期2年，遮光，密閉保存。纈沙坦對照品：中國藥品生物制品檢定所，批號 100651-200401，含量 98.8%。磷酸二氫鉀、磷酸、二氯甲烷為分析純，乙腈和甲醇為色譜純，水為二重蒸餾水。空白血漿由中國醫科大學附屬盛京醫院輸血科提供。

2 方法與結果

2.1 血漿樣品的分析方法

2.1.1 血漿樣品的預處理

取 0.2 mL血漿于具塞玻璃試管中，加入內標0.5 μg·mL-1替米沙坦 50 μL，補加 50 μL 甲醇，加 1 mol·L-1HC l100 μL, 再加入 3 mL 二氯甲烷，震蕩提取15 min，3 500 r/minpm離心10 min, 取下層有機相，與50 ℃水浴中氮氣吹干，于殘渣中加入400 μL流動相，渦旋混合30 s，進樣10 μL

2.1.2 色譜條件

Agilent ZORBAZX Eclipse XDB-C18 柱（4.6×150 mm, 5 μm）；流動相：乙腈：0.01 mol·L-1KH2PO4(pH=2.96)=48︰52(V/V)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：激發波長265 nm，發射波長378 nm；柱溫：30 ℃。

2.2 分析方法確證

2.2.1 方法的專屬性

分別取6名受試者混合空白血漿0.2 mL，按“血漿樣品的分析方法”項下操作，進樣 10 μL，得色譜圖1-A；將一定濃度的纈沙坦加入空白血漿中，依同法操作，得色譜圖1-B；取健康受試者給藥后收集的血漿樣品，依同法操作，得色譜圖1-C。結果表明，血漿中的內源性物質不干擾纈沙坦和內標替米沙坦的測定。

2.2.2 標準曲線的制備

取空白血漿0.2 mL，依次加入濃度為50，100，200，500，1 000，2 000，5 000，10 000，20 000 ng·mL-1的纈沙坦標準系列的甲醇溶液，配制相當于 12.5，50，125，250，500，1 250，2 500，5 000 ng·mL-1的血漿樣品，按“血漿樣品的分析方法”項下的方法操作，制備標準曲線。以血漿中待測物的濃度為橫坐標，以待測物與內標的峰面積比為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸計算，求得直線回歸方程，即為標準曲線。標準曲線回歸方程見表 1。本方法的最低定量限為 12.5 ng·mL-1，線性范圍為12.5~5000 ng·mL-1。

表1 方法確證標準曲線Table 1 Confirming standard curve

2.2.3 準確度與精密度

取空白血漿0.2 mL，按“標準曲線的制備”項下操作，制備纈沙坦低、中、高3個濃度（分別為25，250，2 500 ng·mL-1）的質量控制樣品（QC），6個樣本，重復3個分析批，并與標準曲線同批測定，以當日的標準曲線計算QC樣品的測得濃度，與配制的濃度對照，求得本法的準確度與精密度，數據見表2。

表2 HPLC法測定血漿中纈沙坦的準確度與精密度Table 2 Accuracy and precision of determining valsartan in human plasma by HPLC method

圖1 HPLC法測定血漿中纈沙坦色譜圖Fig.1 Determination of valsartan in human plasma by HPLC

A 空白血漿樣品圖 B 空白血漿樣品加纈沙坦、替米沙坦標準品的色譜圖（替米沙坦 500 ng·mL-1，峰 1； 纈沙坦 2 000 ng·mL-1，峰 2）C 受試者口服纈沙坦膠囊后1.0 h的血漿樣品色譜圖

2.2.4 提取回收率

取空白血漿0.2 mL，按“標準曲線的制備”項下操作，制備纈沙坦低、中、高3個濃度（分別為25，250，2500 ng·mL-1）的樣本，每個濃度進行 6樣本分析。同時另取相同濃度的標準溶液進行分析，獲得相應峰面積的平均值，以每一濃度兩種處理方法的峰面積，計算提取回收率。結果表明，低、中、高三個濃度的平均提取回收率分別為(54.5±4.79)%、(57.1±3.85)%和(64.5±3.01)%，結果見表3。

表3 HPLC法測定血漿中纈沙坦的提取回收率Table 3 Extraction recovery in determination of valsartan in human plasma by HPLC method

2.2.5 穩定性考察

血漿樣品經-20 ℃反復3次凍融，預處理后室溫放置24 h，-20 ℃冰凍放置1個月后，測定樣品濃度。結果顯示所有測定值與初始值的相對誤差（RE %）均小于15%，說明分析測試過程中的樣品較為穩定，結果見表4、表5和表6。

本試驗采取HPLC法測定人血漿樣品中纈沙坦濃度，結果表明，血漿中的內源性物質不干擾待測物的測定。本方法具有快速、專屬、準確、靈敏度高德特點，適合纈沙坦的藥代動力學研究。

表4 HPLC法測定血漿中纈沙坦的穩定性（-20 ℃反復3次凍融）Table 4 The stability of sample in the determination of valsartan by HPLC method（after three times freezing and thawing at -20 ℃）

表5 HPLC法測定血漿中纈沙坦的穩定性（室溫放置24 h）Table 5 The stability of sample in the determination of valsartan by HPLC method （before and after placing 24 h at room temperature）

表6 HPLC法測定血漿中纈沙坦的穩定性（-20 ℃冰凍放置1個月）Table 6 The stability of sample in the determination of valsartan by HPLC method(after freezing for one month at -20 ℃)

2.3 纈沙坦膠囊藥代動力學的研究

2.3.1 受試者選擇

選擇 20名健康男性志愿者，年齡為（23.4±1.64）歲，體質量為（65.2±7.84）kg，體重指數均在 19～24 內。受試者一般體格檢查、心電圖及血尿常規、肝腎功能等實驗室檢查均為正常。受試者無既往慢性病史，無藥物過敏史，無藥物濫用、酗酒、嗜煙史。試驗前3周內及試驗期間未服用其他藥物，試驗前3個月內未獻血或失血，試驗前3個月內未參加其它臨床試驗。試驗前書面告知受試者研究的性質、目的和風險，受試者在充分了解的基礎上自愿簽署知情同意書。

2.3.2 給藥方案與樣品采集

20名受試者于試驗前1日晚進標準晚餐后，禁食不禁水10 h過夜，試驗期間禁飲茶、咖啡及含咖啡因及醇類的飲料，并禁止吸煙。試驗當日晨起空腹口服纈沙坦膠囊 1片（代文，相當于纈沙坦 80 mg），用200 mL溫開水送服，給藥后2 h后可進統一早餐，4 h后進統一清淡午餐，其間飲水適量。于服藥前和服藥后0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0，30.0 h分別采取前臂靜脈血5 mL，置入肝素化離心試管中，離心（3 500 r·min-1）10 min，分離血漿，血漿于－20 ℃冷凍保存。

2.3.3 藥代動力學結果

20名健康受試者口服纈沙坦膠囊1粒后在規定時間內進行血樣采集，用HPLC法對采集到的血漿樣品進行血藥濃度測定，結果見表 7，所得血藥濃度-時間曲線見圖2。

表7 20名健康受試者口服纈沙坦膠囊的藥物動力學參數Table 7 Pharmacokinetics parameters of oral administration valsartan capsule

圖2 20名受試者口服纈沙坦膠囊的平均藥濃度-時間曲線Fig.2 Mean drug concentration-time curve of oral administration valsartan capsule

3 結 論

纈沙坦的HPLC分析方法已有多篇報道[3-10]。

本次實驗采用高效液相色譜法，其方法用來測定血漿中纈沙坦濃度、研究血漿中纈沙坦的藥代動力學，測定了20名健康男性志愿受試者口服纈沙坦膠囊后的不同時刻血漿中纈沙坦的濃度，并根據測定結果求算纈沙坦的藥代動力學參數為與文獻報道基本一致。

纈沙坦分散片的主要藥動學參數：Tmax為(2.3±0.7)h；Cmax為(2 457±1 413)ng·mL-1；T1/2為(5.8±1.1)h；AUC0-t為(14 390±7 040)ng·h·mL-1；AUC0-∞為 (14 736±7 161)ng·h·mL-1。

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