潛陽解毒通絡飲通過PPAR-γ途徑抑制炎癥因子表達從而對自發性高血壓大鼠炎癥機制干預的研究

靳取 鄧悅 常立萍

近期研究發現，炎癥在高血壓的發生中扮演了一個重要的角色［1］。Toll 樣受體4 可參與人體中多種炎癥過程［2］，促進人體血清中超敏C 反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，HS-CRP)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor -a，TNF-a)、白介素1β(interleukin-lβ，IL-1β)等炎癥因子的過多表達，引發炎癥反應［3］，最終導致高血壓病的發生。比格列酮是噻唑烷二酮類藥物(thiazo-lid inediones，TZD)，為一類新型的人工合成的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators activated receptors，PPAR-γ)激動劑，除了通過改善胰島素抵抗(insulin resistance，IR)而發揮降糖作用以外，更可以降低血壓［4］。本實驗從中醫角度入手，采用潛陽解毒通絡飲對自發性高血壓大鼠(SHR)進行治療觀察，與陽性藥纈沙坦和比格列酮作對比，通過ELISA 法和RTPCR 等方法檢測大鼠血清和心臟組織中炎癥因子的表達，來驗證潛陽解毒通絡飲在治療高血壓病中醫證候中“風痰瘀絡”證型的作用與療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性12 周齡原發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)71 只，魏-凱二世大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)10 只(北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號:SCXK(京)2012-0001)。潛陽組后因打斗死亡3 只。

1.2 主要試劑與藥物

大鼠血清因子HS-CRP、TNF-a、IL-1β 的ELISA試劑盒，購于安迪(上海)生物科技有限公司［R＆D Systems (Minneapolis，MN，USA)］。

潛陽解毒通絡飲:夏枯草25 g、石決明25 g、萊菔子15 g、黃連15 g、丹皮25 g、澤瀉15 g、丹參15 g、地龍15 g、牛膝25 g(0.389 g/ml)。潛陽組藥物:夏枯草25 g、石決明25 g、地龍15 g(0.144 g/ml)。解毒組藥物:萊菔子15 g、澤瀉15 g、丹參15 g、黃連15 g(0.133 g/ml)。通絡組藥物:丹皮25 g、丹參15 g、地龍15 g、牛膝25 g(0.178 g/ml)。纈沙坦:80 mg/粒(0.4 g/ml)。吡咯列酮:30 mg/粒(0.3 g/ml)。

將上藥用清水浸泡30 分鐘，6～8 倍水煮2 次，每次煎1.5 小時，待將至常溫后取汁，4℃冷藏。

1.3 主要儀器和設備

酶標儀(美國寶特Bio-Tek ELX800 全自動酶標儀)，大鼠尾動脈無創測量儀Coda20208(美國Kent scientific corporation)，RT-PCR 儀(GT9612)(北京百泰克生物技術有限公司)，紫外分析儀(ZF1-II)(上海嘉鵬科技有限公司)，凝膠成像儀［伯樂生命醫學產品(上海)有限公司，Bio-Rad Laboratiories，USA］。

1.4 動物分組

將SHR 隨機分為潛陽組、解毒組、通絡組、全方組、纈沙坦組、吡格列酮組、SHR 空白對照組及正常血壓對照組，適應性喂養1 周，自由飲水，室溫(20 ±2)℃，高脂飼料。生藥量分別為:潛陽組0.22 g/kg(0.8 ml/天)、解毒組0.15 g/kg(0.65 ml/天)、通絡組0.27 g/kg(0.9 ml/天)、全方組0.58 g/kg(1.95 ml/天)、纈沙坦組0.00027 g/kg(0.16 ml/天)、吡格列酮組0.0001 g/kg(0.1 ml/天)，SHR 對照組及空白對照組每日給予生理鹽水，計量與全方組相同0.58 g/kg(1.95 ml/天)。分別于藥前及給藥后2、4、6、8 周時采用大鼠尾動脈無創血壓測量儀Coda20208測量大鼠安靜清醒狀態下尾動脈收縮壓(SBP)，測量時間固定于測量日早上9∶00～12∶00。每只鼠連續測量SBP 3 次，間隔1～2 分鐘，取平均值。

1.5 標本采集

喂養8 周后，給予25%的烏拉坦腹腔注射，麻醉后經腹主動脈取血4 ml，加入無任何處理的試管中，4℃，3000 r/min 離心10 分鐘，取血清-80℃保存，用于炎性因子水平的檢測;經腹主動脈取血后，立即打開胸腔，迅速取出心臟，冰生理鹽水沖洗后，垂直于左心室長軸切取左室中部組織，經液氮速凍后置-80℃冰箱保存備用。

采用大鼠血清因子ELISA 試劑盒測各組標本血清中HS-CRP、TNF-a、IL-1β 的濃度。

RT-PCR 法監測大鼠心肌組織中TNF-a、TLR4及PPAR-γ 的mRNA 的表達。全方組、解毒組、潛陽組、通絡組、沙坦組、列酮組、SHR 組及Control 組在高脂飼料喂養8 周后處死，取心肌組織，用SimplyP總RNA 提取試劑盒提取上述組織的總RNA，測定純度并定量后采用BioRT cDNA 第一鏈合成試劑盒使用說明書合成第一鏈cDNA，于(北京百泰克生物技術有限公司GT9612)PCR 儀行RT-PCR 反應。目的基因TNF-a，Forward Primer:5‘-TCTCAAAACTCGAGTGACAAG-3'，Reverse Primer:5'-AGTTGGTTGTCTTTGAGATCC-3'，產物長度446 bp;TLR4 Forward Primer:5'-ATTTCTTGGCTTGATCAGTC-3'，Reverse Primer:5'-GGATGTCTCTATGCGATTG-3'，產物長度280 bp;PPAR-γ Forward Primer:5'-TCAGGTTTGGGCGAATG-3'，Reverse Primer:5'-TTTGGTCAGCGGGAAGG-3'，擴增產物長度152 bp;β-actin內參照物，Forward Primer:5'-CCCATCTATGAGGGTTAC-3'，Reverse Primer:5'-TCACGCACGATTTCC-3'，特異性擴增片段為143 bp。反應條件為:94℃預變性3 分鐘;94℃變性30 秒，52℃退火30 秒，72℃延伸60 秒，72℃最后延伸5 分鐘，共30 個循環。反應結束，由凝膠成像儀(Bio-Rad Laboratiories，USA)進行拍照后，用Alpha VIEW SA 分析軟件進行分析。

1.6 統計學分析

采用SPSS 13.0 統計軟件對數據進行分析。各組實驗數據以表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVAS)，以P ＜0.05 為有統計學意義，以P ＜0.01 有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠尾動脈收縮壓

治療前，各治療組間大鼠尾動脈收縮壓經單因素方差分析，F=1.024，P =0.422，P ＞0.05，差異無統計學意義;治療第8 周，各治療組間大鼠尾動脈收縮壓經單因素方差分析，F=2.352，P=0.032，P ＜0.05，差異有統計學意義，經兩兩比較后發現，全方組與正常血壓對照組血壓差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 治療前、治療第8 周各組大鼠的尾動脈收縮壓(±s)

表1 治療前、治療第8 周各組大鼠的尾動脈收縮壓(±s)

注:與正常血壓對照組相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01

組別n第1 周血壓(mmHg) 第8 周血壓(mmHg)全方組11179.0 ±11.84135.7 ±23.80 b解毒組10181.7 ±18.05147.2 ±22.12a潛陽組7182.6 ±20.64142.0 ±13.96a通絡組10177.4 ±11.95135.6 ±31.25b沙坦組10174.9 ±12.19136.1 ±8.57b列酮組10182.4 ±14.59142.7 ±13.32b SHR 空白對照組 10183.7 ±13.01165.3 ±7.48正常血壓對照組 1094.2 ±14.6188.7 ±13.22 b

2.2 ELISA 法測各組大鼠血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-a 的濃度

經全方組治療的大鼠，血清中IL-1β 濃度低于其他治療組，經單因素方差分析，F =10.051，P =0.001，P ＜0.05，有統計學意義，經兩兩比較后發現，全方組與正常血壓對照組有的IL-1β 濃度有顯著性差異(P ＜0.05);TNF-a 濃度低于其他治療組，經單因素方差分析，F =3.569，P =0.017，P ＜0.05，有統計學意義，經兩兩比較后發現，全方組與正常血壓對照組有的TNF-a 濃度有極顯著性差異(P ＜0.01);hs-CRP 濃度低于其他治療組和對照組，經單因素方差分析，F=2.381，P =0.071，P ＞0.05，無統計學意義。全方組在與普通組相比，有不同程度的顯著性降低 hs-CRP、TNF-a 及 IL-1β 的表達(P ＜0.05，P ＜0.01)，見表2。

表2 各組大鼠血清中hs-CRP、TNF-a、IL-1β 的濃度(±s)

表2 各組大鼠血清中hs-CRP、TNF-a、IL-1β 的濃度(±s)

注:與普通組相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01

組別nhs-CRP(ng/ml)TNF-a(ng/ml)IL-1β(pg/ml)全方組113.58 ×10 -4 ±0.095 ×10 -9 b77.81 ×10 -4 ±4.564 ×10 -9 b0.54 ×10 -4 ±0.023 ×10-12 a解毒組104.32 ×10 -4 ±0.076 ×10 -985.72 ×10 -4 ±4.479 ×10 -9 b0.45 ×10 -4 ±0.055 ×10 -12 a潛陽組74.08 ×10 -4 ±0.163 ×10 -9126.45 ×10 -4 ±11.049 ×10 -9 b0.49 ×10 -4 ±0.036 ×10 -12 b通絡組104.40 ×10 -4 ±0.289 ×10 -9 a121.79 ×10 -4 ±2.650 ×10 -90.64 ×10 -4 ±0.047 ×10 -12沙坦組104.19 ×10 -4 ±0.142 ×10 -980.85 ×10 -4 ±4.481 ×10 -90.55 ×10 -4 ±0.011 ×10 -12列酮組104.24 ×10 -4 ±0.101 ×10 -993.42 ×10 -4 ±3.060 ×10 -9 b1.01 ×10 -4 ±0.192 ×10 -12 SHR 空白對照組104.40 ×10 -4 ±0.169 ×10 -9 a120.17 ×10 -4 ±11.410 ×10 -9 b0.91 ×10 -4 ±0.311 ×10 -12正常血壓對照組104.07 ×10 -4 ±0.243 ×10 -954.62 ×10 -4 ±15.843 ×10 -90.38 ×10 -4 ±0.050 ×10-12

2.3 RT-PCR 法測PPAR-γ、TNF-a 及TLR4 的mRNA 在大鼠心肌細胞中的表達

經全方組治療的大鼠，與SHR 空白對照組及正常血壓對照組對比，可顯著降低TNF-a 及TLR4 在大鼠心肌組織中的表達(P ＜0.05)，增加PPAR-γ 在大鼠心肌組織中的表達(P ＜0.05)。在計算TNF-a 時，經單因素方差分析，F=1.068，P=0.426，P ＜0.05，有統計學意義，經兩兩比較后發現，全方組與正常血壓對照組有的TNF-a 濃度有極顯著性差異(P ＜0.01);在計算TLR4 時，經單因素方差分析，F =2.157，P=0.096，P ＜0.05，有統計學意義，經兩兩比較后發現，全方組與正常血壓對照組有的TLR4 濃度有顯著性差異(P ＜0.05);在計算PPAR-γ 時，經單因素方差分析，F=1.339，P=0.296，P ＜0.05，有統計學意義，經兩兩比較后發現，全方組與正常血壓對照組有的PPAR-γ濃度有極顯著性差異(P ＜0.01);見表3，圖1～3。

圖1 各組藥物對大鼠心肌細胞中PPAR-γmRNA表達的比較

圖2 各組藥物對大鼠心肌細胞中TNF-a mRNA表達的比較

圖3 各組藥物對大鼠心肌細胞中TRL4 mRNA表達的比較

表3 各組藥物對大鼠心肌細胞中PPAR-γ、TNF-a、TLR4 的mRNA 表達的比較(±s)

表3 各組藥物對大鼠心肌細胞中PPAR-γ、TNF-a、TLR4 的mRNA 表達的比較(±s)

注:與普通組組比，aP ＜0.05，bP ＜0.01

組別nPPAR-γ(u/ml)TNF-a(u/ml)TLR4(u/ml)全方組11122.38 ×10 -4 ±9.878 ×10 -4 b82.04 ×10 -4 ±13.751 ×10 -4 a123.99 ×10 -4 ±9.438 ×10-4 b解毒組1079.63 ×10 -4 ±6.609 ×10 -4 b121.59 ×10 -4 ±22.618 ×10 -4 b126.16 ×10 -4 ±25.352 ×10 -4 b潛陽組784.78 ×10 -4 ±5.186 ×10 -4 b89.04 ×10 -4 ±16.696 ×10 -4 b74.38 ×10 -4 ±4.993 ×10 -4 a通絡組1069.00 ×10 -4 ±7.034 ×10 -4 b113.90 ×10 -4 ±28.187 ×10 -4 b99.68 ×10 -4 ±2.283 ×10 -4 b沙坦組1076.50 ×10 -4 ±1.432 ×10 -4 b157.92 ×10 -4 ±18.089 ×10 -4 b136.90 ×10 -4 ±8.216 ×10 -4 b列酮組1071.69 ×10 -4 ±7.072 ×10 -4 b107.69 ×10 -4 ±14.737 ×10 -4 b70.30 ×10 -4 ±6.168 ×10 -4 b SHR 空白對照組1056.98 ×10 -4 ±6.243 ×10 -4141.64 ×10 -4 ±15.708 ×10 -4 b123.04 ×10 -4 ±11.059 ×10 -4正常血壓對照組1049.32 ×10 -4 ±8.756 ×10 -446.32 ×10 -4 ±4.209 ×10 -4 b102.81 ×10 -4 ±15.947 ×10-4

3 討論

高血壓病是危害人類健康的主要殺手，糖尿病、心臟病、腦卒中都與血壓長期升高有密切關系［5］。研究發現，炎癥因子在高血壓的發生、發展及轉歸中占有重要的作用［6］。而各類炎癥因子的上游基因TLR4 如何介導炎癥反應的發生，現已成為研究熱點。已有研究表明，TLRs 與心血管疾病發生與發展有著緊密的聯系［7-8］。從TLRs 信號傳導通路入手，找出其重要節點加以阻斷，將成為控制炎癥反應的重要手段，從而對由TLRs 信號通路激活導致的高血壓、心肌肥厚等疾病進行有效的治療。近年來對TLRs 信號轉導通路的研究顯示:NF-κB 是TLR4 信號轉導MyD88 途徑中重要的級聯信號因子之一。TLR4/NF-κB 被激活后，各種激活誘導物(如細胞因子TNF-α，IL-1β)作用于NF-κB，使得其表達增加，導致IL-1β、TNF-α 及hs-CRP 等炎癥因子表達增加，發生炎癥反應，同時這些炎癥因子再作用于NF-κB，形成一個炎癥循環［9］。可以說，致炎癥因子TNF-α、IL-1β 既是TLR4/NF-κB 信號通路活化的上游因素，又是TLR4/NF-κB 信號通路活化的產物，兩者相互作用，互為因果，形成炎癥因子網絡，使得高血壓病得以發生及發展。現已證實，吡格列酮作為人工合成的是噻唑烷二酮(TZD)藥物，可通過抗炎作用逆轉原發性高血壓左心室肥厚，可在臨床廣泛應用于糖尿病合并高血壓患者。這給今后臨床在治療高血壓病提供了一個新的思路和選擇。

基于現代高血壓病的研究，各種機制導致的全身小動脈血管收縮為引起高血壓的主要表現，中醫理論認為高血壓屬絡病［10-11］，屬本虛標實，或虛實夾雜之病證。不同原因導致的脈絡絀急(“陽亢”—絡風內動)為高血壓發病的基礎和主要機制，與現代生活方式不良密切相關，飲食不節，醇甘厚味(咸能入血)，滋生“痰濁”、“瘀血”為主要致病因素和病理變化，痰瘀互結，絡脈受損，氣血運行受阻，致太過不及，“陽亢”而絡風內動，而有“痰瘀阻絡，脈絡絀急”為主要致病機制。瘀血痰濁，郁腐成毒，熱毒化風，日久導致“毒損心絡”，從而導致心臟發生肥厚重塑及心力衰竭。潛陽解毒通絡飲是基于“痰濁、血瘀、陽亢”的高血壓病理變化和“痰瘀阻絡、脈絡絀急、毒損心絡”的高血壓心肌肥厚病理機制而設，顯示出平穩的降壓作用，與郭宇光［12］等研究結果基本相同。

本實驗采用潛陽解毒通絡飲對自發性高血壓大鼠進行治療觀察，實驗發現:(1)潛陽解毒通絡飲能夠有效降低原發性高血壓大鼠(SHR)的血壓，降壓趨勢與陽性對照組相類似，但無統計學意義(P ＞0.05)。(2)潛陽解毒通絡飲能夠有效抑制SHR 大鼠血清中IL-1β、TNF-α 及hs-CRP 炎癥因子的表達(P ＜0.05)。提示潛陽解毒通絡飲可以從炎癥角度對高血壓進行干預。(3)分子生物學實驗結果顯示，潛陽解毒通絡飲能夠顯著增加PPAR-γ 在原發性高血壓大鼠(SHR)心肌組織中的表達，同時抑制TLR4及TNF-α 在心肌組織中的表達(P ＜0.05)。中藥干預原發性高血壓大鼠(SHR)心肌組織中TLR4 及NF-κB 上游物質TNF-α 的基因表達明顯降低，提示潛陽解毒通絡飲抑制了炎癥反應中TLR4 及TNF-α的轉錄與復制。

綜上，實驗證明中藥潛陽解毒通絡飲通過作用于PPAR-γ 途徑介導抑制炎癥因子表達，是其主要作用機制之一。其詳細作用機制，尚待進一步研究。

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