青蒿酯對房顫大鼠心肌核轉錄因子-κB表達的干預作用

焦華琛 張蘊慧 李運倫

核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NFκB)是一種多效可誘導的轉錄因子，除了能夠調節多種基因的表達、產生細胞因子，還能調節多種炎癥因子的表達和細胞凋亡。NF-κB 對免疫應答、炎癥反應、細胞分化和生長、細胞粘附和細胞凋亡所必需的多種細胞因子、粘附因子具有調節作用。前期多項研究表明:炎癥因子NF-κB 在心血管疾病的發生過程中具有重要的意義。同時，NF-κB 在腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)的產生中也起重要作用。為觀察NF-κB 與房顫發生的關系，筆者進行了以下實驗:

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

SD 大鼠40 只，體重(250 ±20)g 左右，由山東大學實驗動物中心提供，合格證號3CX1〈魯〉2009001。卡托普利由廣州白云山制藥廠生產，批號110754。青蒿酯由西安小草植物科技有限責任公司生產，批號SC101213。戊巴比妥鈉由上海華藍化學科技有限公司進口分裝，批號57330。RIPA 裂解液由碧云天生物技術研究所提供，批號P0013B。Trizol 試劑盒由生工生物工程(上海)有限公司生產，批號1102111W。

1.2 動物模型建立及分組

SD 大鼠按數字隨機表法分為空白對照組10只，模型組10 只、青蒿酯組10 只、卡托普利組10只，采用氯化鈣、乙酰膽堿混合液以舌下靜脈給藥的方式建立房顫動物模型。用1%的戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉，先描記大鼠正常心電圖。舌下靜脈注射氯化鈣、乙酰膽堿混合液1 mL·kg-1，描記心電圖，待出現典型房顫f 波。模型組、青蒿酯組、卡托普利組的30 只大鼠均按此方法每日給藥，常規喂養，連續給藥4 周，停藥后心電圖仍有典型房顫改變為造模成功。3 組各有9 只大鼠造模成功。實驗前2 周青蒿酯組以1.25 g 生藥/kg 灌胃。卡托普利組以3.25 mg/kg 灌胃。空白對照組實驗結束時為9 只。

1.3 PCR 引物設計［2］

選用肌動蛋白-β(β-actin)作為內參照。Trizol法提取總RNA。紫外分光光度計測定RNA 純度及含量。引物序列如下:NF-κB:正向 5'-TCTGAGACTCCGTGAAA-3'，反向 5'-CAGACTGACTTTATGGGAAC-3'。52℃退火，循環30 次，擴增片段285 bp。β-actin:5'-GCTGTCCCTGTACGCCTCTG-3'，反向5'-GCTTCTCCTTGATGTCCCGC-3'。59℃退火，循環30 次，擴增片段230 bp。用分光光度計測定吸光度，換算成mRNA 濃度。

1.4 Western-blot 法檢測NF-κB 表達

實驗當日處死動物，取左心房組織［1］，制成勻漿，使用RIPA 裂解液，再加入100 mg/L 蛋白酶抑制劑提取組織蛋白，并測定蛋白濃度。制作12%的分離膠和5%的積層膠，電泳結束后，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉3 小時，加入一抗，4℃孵育過夜，TBS-T 溶液洗膜4次，每次15 分鐘。室溫下加二抗孵育2 小時，洗膜4 次，用增強化學發光法顯色，凝膠成像分析系統攝像分析并得出灰度值。

1.5 統計學分析

使用SPSS 16.0 統計軟件進行統計處理。NFκB 表達以灰度值統計，NF-κB mRNA 表達計量資料以表示，兩組間比較采用t 檢驗，組間比較采用單因素方差分析。P ＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 房顫大鼠心肌NF-κB mRNA 表達結果顯示:模型組與對照組采用t 檢驗進行分析，在NF-κB mRNA 表達方面相比P ＜0.05(P =0.024)，證明房顫大鼠心肌中NF-κB mRNA 的表達較正常大鼠明顯增加。青蒿酯組與模型組采用t 檢驗分析，兩組相比P ＜0.05(P =0.018)，說明青蒿提取物可明顯降低炎癥因子NF-κB mRNA 的表達，卡托普利與模型組采用t 檢驗分析，兩組相比P ＞0.05(P =0.061)，即說明卡托普利對該因子的表達沒有影響。

表1 各組大鼠心肌NF-κB mRNA 的表達(±s)

表1 各組大鼠心肌NF-κB mRNA 的表達(±s)

注:與對照組相比，aP ＜0.05;與模型組相比bP ＜0.05;與模型組相比cP ＞0.05

模型組對照組青蒿組卡托普利組NF-κB 0.92 ±0.08a 0.23 ±0.10 0.36 ±0.08b 0.91 ±0.07 c

2.2 Western-blot 法檢測房顫大鼠心肌NF-κB 表達

正常情況下，大鼠心肌中有一定NF-κB 表達，在本實驗中，對照組NF-κB 表達的灰度值是最低的，青蒿酯組次之，模型組最高。灰度值越低，蛋白表達的水平越高。因此可以得出結論:房顫發生后，心肌NF-κB 的表達明顯增強。四組間經單因素方差分析，證明青蒿酯能夠有效降低炎癥因子NFκB 的表達(P =0.034，P ＜0.05)，而卡托普利對NF-κB 沒有影響(P =0.067，P ＞0.05)。蛋白表達及灰度值直方圖見圖1、2。

圖1 房顫大鼠心肌細胞NF-κB 蛋白的表達

圖2 房顫大鼠心肌細胞NF-κB 表達灰度值統計結果(n=9)

3 討論

NF-κB 與動脈粥樣硬化、心衰、缺血再灌注等心血管疾病有密切的聯系。NF-κB 是一種重要的基因轉錄調節分子，它可與多種蛋白質基因啟動子或增強子的κB 序列特異結合，誘導基因表達增強。NFκB 是由p50 和p65 兩個蛋白亞基組成，是炎癥反應的中樞調節物［3］。NF-κB 激活通路廣泛存在于內皮細胞、平滑肌細胞及心肌細胞中。NF-κB 是1986年從B 淋巴細胞核中檢測到的一種核蛋白因子，它能與免疫球蛋白κ 的輕鏈基因增強子κB 序列特異性地結合，故稱為NF-κB［4］。

NF-κB 是TGF-β 的上游調控因子。活化的NFκB 進入細胞核后能夠促進靶基因轉錄，可高效誘導多種成分的表達:(1)細胞因子，如TGF-β、IL-6 等;(2)黏附分子，如ICAM-1、VCAM-1 等;(3)趨化因子;(4)急性反應蛋白;(5)調控炎癥反應放大與延續的酶［5］。

NF-κB 與心律失常關系密切。前期研究已經發現，房顫大鼠心肌TNF-α 的表達是上調的，青蒿酯與卡托普利均能減低TNF-α 的表達。NF-κB 是TNF-α 的上游調節因子。本研究在既往研究的基礎上以青蒿酯作為研究對象，觀察青蒿酯對房顫大鼠心肌中NF-κB 表達的干預作用。

本研究發現:正常大鼠心肌中有少量NF-κB 表達，房顫發生后，心肌NF-κB mRNA 的表達明顯增強。青蒿酯能夠有效降低炎癥因子NF-κB mRNA的表達(P ＜0.05)，而卡托普利對NF-κB mRNA 沒有影響(P ＞0.05)。Westing-blot 法的結果證明這證明青蒿提取物降低TNF-α 是通過干預NF-κB 表達實現的，而卡托普利并非通過這一途徑實現的。

［1］ 姜楠，梁曉春，屈嶺，等.筋脈通膠囊對糖尿病大鼠坐骨神經形態測量學及核轉錄因子κB 蛋白表達的影響［J］.環球中醫藥，2012，5(2):100-104.

［2］ 趙凱，錢月慧，程曉東.TNF-α、NF-κB 在動脈粥樣硬化閉塞癥兔動脈中的表達變化［J］.寧夏醫科大學學報，2012，34(1):14-16.

［3］ 陳志成，陳國忠，吳曉智，等.上胸段硬膜外阻滯對蛛網膜下隙出血兔基底動脈NF-κB 和COX-2 表達的影響［J］. 醫學綜述，2012，18(14):2279-2282.

［4］ 李恩，劉宗芳，孫利強，等.CT-1、NF-κB 在心肌梗死大鼠心室重塑中的表達及羅格列酮的作用［J］.西安交通大學學報(醫學版)，2011，32(1):54-56，92.

［5］ Siebenlist U，Franzoso G，Brown K，et al.Structure，regulation and function of NF-κB［J］. Annu Rev Cell Biol，1994，10:405-455.