慢性淺表性胃炎大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡與中醫(yī)證型的相關(guān)性

王麗 王垂杰 孫曉婷

慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis，CSG)是由多種原因引起的慢性胃粘膜淺表性炎癥，此病是目前發(fā)病率較高的消化系統(tǒng)疾病之一。相關(guān)研究調(diào)查［1］得出結(jié)論，脾虛證和濕熱證是其中較多見的證型。細(xì)胞凋亡是機(jī)體重要生理功能之一，在各組織器官、系統(tǒng)中都存在，而在胃粘膜的炎癥病理變化中凋亡細(xì)胞明顯增多［2］。本研究復(fù)制慢性淺表性胃炎大鼠脾虛證和濕熱證病證結(jié)合模型，采用原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測大鼠胃上皮細(xì)胞凋亡水平，采用RT-PCR 法檢測凋亡調(diào)控基因Bcl-2 mRNA 表達(dá)，以期從細(xì)胞凋亡的角度揭示CSG不同證候的實質(zhì)，為建立“證”的微觀辨證體系標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD 大鼠40 只［合格證號:SCXK(京)2007-0001］，體重(170 ±20)g，雌雄各半。

1.2 分組與造模

［3-5］方法進(jìn)行模型復(fù)制。用隨機(jī)數(shù)字表法選取10 只作為正常對照組，每天灌胃2 ml生理鹽水直至造模結(jié)束，其它30 只按體重每天灌5%水楊酸鈉溶液10 ml/(kg·d)，第一階段造模時間為3 周。3 周后，將這30 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組，分別為單純CSG 組、脾虛CSG 組、濕熱CSG 組。每組大鼠在每天灌胃5%水楊酸鈉溶液10 ml/(kg·d)的同時，單純CSG 組不給其它處理因素，脾虛組用破氣苦降與饑飽失常法造脾虛模型，用小承氣湯(大黃12 g、厚樸15 g、枳實9 g)換算成動物劑量濃縮后10 ml/(kg·d)每天1 次灌胃，隔天半量飲食，自由飲水;濕熱組予200 g/L 的蜂蜜水自由飲用，隔日灌服10 ml/(kg·d)白酒，與白酒隔日灌服10 ml/(kg·d)油脂。第二階段造模時間為2周。由于灌胃不慎及其它原因所致，濕熱CSG 組大鼠死亡兩只，脾虛CSG 組大鼠死亡1 只。

1.3 主要試劑

凱基一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒，購自凱基生物公司。Trizol 試劑盒、RT-PCP 試劑盒、引物(2 對)、瓊脂糖均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 指標(biāo)檢測

大鼠禁食24 小時，處死，剖開腹腔，迅速剪取胃組織100 mg，生理鹽水沖洗后，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1 TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡水平 將胃組織制作石蠟切片→脫蠟、水合→細(xì)胞通透→加TUNEL 反應(yīng)液→加converter-POD→與底物DAB 反應(yīng)顯色→光學(xué)顯微鏡計數(shù)并拍照。每組按隨機(jī)數(shù)字表法取5只大鼠，每只取1 張切片，每個切片隨機(jī)觀察5 個視野(視野放大200 倍)，用BP70 圖像分析軟件(Olympus 公司)分析細(xì)胞凋亡結(jié)果，分別計數(shù)每個視野陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞數(shù)，取平均值作為切片陽性細(xì)胞數(shù)和陰性細(xì)胞數(shù)，以凋亡陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)(陽性細(xì)胞數(shù)與陰性細(xì)胞數(shù)之和)的比率作為該切片的細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4.2 RT-PCR 法檢測凋亡調(diào)控基因 Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平經(jīng)過總RNA 提取→測總RNA 純度→逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA→PCR 擴(kuò)增→瓊脂糖凝膠電泳后，使用Gelpro32 凝膠成像分析軟件分析各條帶光密度值，用目的基因(Bcl-2 mRNA)/內(nèi)參基因(βactin mRNA)光密度值計算RNA 指數(shù)(RI)表示RNA 含量。RI =目的基因光密度值/β-actin mRNA光密度值。每組隨機(jī)取5 只大鼠。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0 處理，實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。P ＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

各組大鼠胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)排列順序為脾虛CSG 組＞濕熱CSG 組＞單純CSG 組＞正常組。各組數(shù)值結(jié)果經(jīng)Levene 檢驗方差齊，總體有差異，多組間比較采用LSD 法:正常組與其它3 組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01);脾虛CSG 組與濕熱CSG 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，脾虛CSG 組與單純CSG 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，見表1。病理見圖1。

表1 各組大鼠胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s)

表1 各組大鼠胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s)

注:與正常組比較，aP ＜0.01;與脾虛CSG 組比較，bP ＜0.05，cP ＜0.01

組別視野細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)正常組250.07 ±0.03單純CSG 組250.35 ±0.07ac濕熱CSG 組250.37 ±0.07ab脾虛CSG 組250.43 ±0.09 a

2.2 各組大鼠胃粘膜凋亡調(diào)控基因Bcl-2 mRNA表達(dá)比較

RT-PCR 產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，各組大鼠胃組織Bcl-2 mRNA 的RT-PCR 產(chǎn)物為大小約367 bp的條帶，內(nèi)參基因β-actin mRNA 的RT-PCR 產(chǎn)物大小約227 bp 的條帶，用目的基因/內(nèi)參基因光密度值計算RNA 指數(shù)。各組數(shù)值結(jié)果經(jīng)Levene 檢驗方差齊，總體有差異，多組間比較采用LSD 法:3 個模型組較正常組Bcl-2 mRNA 表達(dá)均降低，脾虛CSG組Bcl-2 mRNA 表達(dá)最低，與單純CSG 組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，與正常組及濕熱CSG組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，見表2，圖2。

圖1 各組大鼠胃粘膜上皮病理圖

表2 各組大鼠胃粘膜凋亡調(diào)控基因Bcl-2 表達(dá)比較(±s)

表2 各組大鼠胃粘膜凋亡調(diào)控基因Bcl-2 表達(dá)比較(±s)

注:與脾虛CSG 組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01

組別n Bcl-2 mRNA 強度 內(nèi)參強度Bcl-2 mRNA/內(nèi)參正常組576.31 ±1.5489.22 ±1.000.86 ±0.011 b單純CSG 組 566.43 ±4.0486.44 ±0.830.77 ±0.045a濕熱CSG 組 569.12 ±1.8485.63 ±1.080.81 ±0.040b脾虛CSG 組559.34 ±5.4687.98 ±0.800.67 ±0.058

圖2 Bcl-2 mRNA 與β-actin mRNA 的RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖

3 討論

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是細(xì)胞在一定的生理病理條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程，在各組織器官、系統(tǒng)中都存在。正常胃粘膜的結(jié)構(gòu)和功能依賴于粘膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡之間的動態(tài)平衡，而二者的失衡就可能引起病變。

Bcl-2 家族蛋白是在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的一類蛋白質(zhì)。目前已經(jīng)在哺乳動物、線蟲和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)并鑒定出了Bcl-2 家族的20 余種蛋白質(zhì)，根據(jù)它們在細(xì)胞凋亡中的作用可分為兩類，一類是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2 等十余個成員;另一類是促凋亡蛋白。Bcl-2 可抑制多種組織的細(xì)胞凋亡，而且很可能是阻止凋亡最后的共同的途徑［6］。

本實驗通過觀察慢性淺表性胃炎不同證型胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)控基因Bcl-2 表達(dá)情況，探討同一病理病變不同證型在細(xì)胞凋亡方面的差異所在。正常胃粘膜凋亡細(xì)胞較少，而在胃粘膜的炎癥病理變化中凋亡細(xì)胞明顯增多。本實驗發(fā)現(xiàn)各組大鼠胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)排列順序為脾虛CSG 組＞濕熱CSG 組＞單純CSG 組＞正常組。濕熱CSG 組其胃粘膜炎癥反應(yīng)明顯，細(xì)胞凋亡增多，而脾虛CSG 組為虛證，胃粘膜功能減退，細(xì)胞凋亡增加。

本實驗發(fā)現(xiàn)三個模型組較正常組Bcl-2 mRNA表達(dá)均降低，脾虛CSG 組Bcl-2 mRNA 表達(dá)最低，與其它三組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，與單純CSG 組比較，P ＜0.05，與正常組及濕熱CSG 組比較，P ＜0.01。可以得出結(jié)論，各組大鼠Bcl-2 mRNA 表達(dá)情況與各組凋亡情況呈負(fù)相關(guān)，這與以往的部分報道相一致，認(rèn)為不同胃粘膜病理Bcl-2 蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

本實驗表明，慢性淺表性胃炎不同證型大鼠根據(jù)其證的不同凋亡指數(shù)亦不同，其中脾虛CSG 組凋亡指數(shù)高于濕熱CSG 組。另凋亡過程的發(fā)生與Bcl-2 的表達(dá)有密切的關(guān)系。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ 謝淑穎，周曉虹. 慢性胃炎的中醫(yī)常見證型研究［J］. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，11(4):53-54.

［2］ 高碧珍，蘭啟防，李燦東，等.慢性胃炎證候與幽門螺桿菌及Bcl-2 蛋白的相關(guān)性研究. 福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2003，12，13(6):1-3.

［3］ 翁一潔，鄭學(xué)寶.大鼠內(nèi)因濕熱造模方法研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(2):479-480.

［4］ 王利芳，喬樵，朱曙東.云香復(fù)合胃痛膠囊對慢性淺表性胃炎大鼠胃分泌功能的影響［J］. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2008，16(6):372-374.

［5］ 宋雅芳，王汝俊，劉友章，等.健脾益氣中藥對脾虛大鼠肝組織線粒體功能的影響［J］. 中藥新藥與臨床藥理，2009，20(5):423-426.

［6］ 彭黎明，王曾禮.細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)與臨床［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:412-414.