HPLC法測(cè)定漿水中有機(jī)酸的含量*

張培，李昕，劉蕓，劉曄瑋，駱姍，邸多隆，唐運(yùn)昌

1(蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所，甘肅蘭州，730000)2(中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中科院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州，730000)

漿水是我國(guó)西北地區(qū)極具特色的發(fā)酵食品，一般是將原料(芹菜或苦苦菜等)先焯水后，再放入熱水中，用老漿水為引子，再加入面湯直至發(fā)酵成熟，湯汁略呈乳白色，口味酸醇清香，多在夏季釀制。漿水具有減肥、開胃、健身等功效［1－2］。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于漿水的研究主要是漿水中微生物的分離鑒定［3－5］，而對(duì)其中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的研究較少。漿水富含有機(jī)酸，其有機(jī)酸的含量和種類維持漿水的酸堿平衡，影響漿水的口感及生物穩(wěn)定性。適量的有機(jī)酸能促進(jìn)食欲，幫助消化，利于人體健康［6－7］。

高效液相色譜法分析有機(jī)酸簡(jiǎn)單快速，可同時(shí)測(cè)定多種有機(jī)酸［8－9］，近年來不斷有文獻(xiàn)報(bào)道利用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵食品中有機(jī)酸的方法［10－12］。本試驗(yàn)采用HPLC法，通過優(yōu)化分析條件，建立了漿水中有機(jī)酸含量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 樣品

蘭州市售漿水。

1.2 主要試劑

甲醇(色譜純)，山東禹王集團(tuán);KH2PO4(AR)，西隴化工廠;超純水，實(shí)驗(yàn)室自制;H3PO4(AR)，天津歐博凱化工;酒石酸(AR)，上海圣宇化工;乙酸(AR)，煙臺(tái)雙雙化工;乳酸(AR)，天津光復(fù)精細(xì)化工;富馬酸(AR)，鄭州盛源化工。

1.3 儀器及設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀系統(tǒng)(包括G1311A四元梯度泵、G1315B DAD二極管陣列檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器和Agilent Chemstation工作站);Agilent ZORBAX SB-AQ 色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，大連依利特C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器;高壓抽濾機(jī)，奧特賽恩斯公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的制備

分別精密稱取一定量酒石酸、乳酸、乙酸、富馬酸，用雙蒸水配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液;精密量取一定量各標(biāo)準(zhǔn)溶液混合定容后，得到有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度分別為酒石酸0.4 mg/mL，乳酸6 mg/mL，乙酸1 mg/mL，富馬酸1 ×10－3mg/mL。

取適量漿水在8 000 r/min下離心10 min，取上清液備用。進(jìn)樣前溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.4.2 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-AQ柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;流動(dòng)相:甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4溶液(體積比 0.5∶99.5，KH2PO4溶液pH=2.0);流速:0.6 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μL。在優(yōu)選的色譜條件下，將1.4.1項(xiàng)下制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液分別進(jìn)樣分析(見圖1)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在200～600 nm對(duì)各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的光譜吸收進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，λ=210 nm時(shí)，各有機(jī)酸都有較大吸收峰，所以選擇210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC色譜圖Fig.1 The chromatogram of standard substance and sample

2.1.2 色譜柱的選擇

選用Agilent ZORBAX SB-AQ色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和大連依利特C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，對(duì)樣品在2種色譜柱上的不同色譜行為進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，采用C18色譜柱，在不同比例甲醇-KH2PO4溶液、不同 pH值不同濃度的KH2PO4溶液作為流動(dòng)相時(shí)樣品中各有機(jī)酸均很難完全分離(見圖2)。而采用AgilentZORBAX SB-AQ色譜柱，在一定的條件下樣品中各有機(jī)酸分離結(jié)果較好(見圖1B)，故選用AgilentZORBAX SB-AQ柱。

2.1.3 緩沖溶液濃度的選擇

精密稱取一定量的KH2PO4，分別配制成濃度為0.005 mol/L，0.01 mol/L，0.02 mol/L 的緩沖溶液，考察緩沖液濃度對(duì)樣品中各有機(jī)酸分離效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)KH2PO4溶液濃度為0.01 mol/L時(shí)，各有機(jī)酸分離效果較好(見圖1B、圖3)。

圖2 C18色譜柱樣品色譜圖Fig.2 The sample chromatogram of C18column

圖3 濃度為0.005 mol/L，0.02 mol/L的KH2PO4緩沖溶液色譜圖Fig.3 The chromatogram of KH2PO4buffer solution concentration at 0.005 mol/L and 0.02 mol/L

2.1.4 pH值的選擇

以0.01 mol/L KH2PO4溶液作流動(dòng)相，用H3PO4調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值分別為4.0、3.0和2.0，考察流動(dòng)相pH值對(duì)樣品中有機(jī)酸分離的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pH=2時(shí)，各有機(jī)酸分離效果較好(見圖1B、圖4)。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性方程、線性范圍和檢出限

配制一系列不同濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.4.2色譜條件分析，以被檢測(cè)物的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸;檢出限以信噪比(S/N)大于3時(shí)的檢測(cè)濃度計(jì)算。4種有機(jī)酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)和檢出限見表1。從表1可以看出，在酒石酸、乳酸、乙酸、富馬酸的濃度分別為0.003～0.1 mg/mL，0.48～24 mg/mL，0.02～0.9 mg/mL，0.001～0.07 mg/mL范圍內(nèi)，4種有機(jī)酸呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖4 pH=3和pH=4樣品的色譜圖Fig.4 The chromatogram of sample at pH=3 and pH=4

表1 4種有機(jī)酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍與檢出限(n=3)Table 1 The linear equation，related coefficient，range of linearity and detection limit of the four organic acids(n=3)

2.2.2 方法精密度考察

按1.4.1條件處理樣品后，按1.4.2色譜條件連續(xù)測(cè)定5次，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)進(jìn)樣3 d，考察日間精密度。結(jié)果見表2。從表2可以看出，4種有機(jī)酸的日內(nèi)精密度的RSD%小于2%，日間精密度的RSD%小于5%，由此表明該液相色譜檢測(cè)方法精密度良好。

表2 4種有機(jī)酸的精密度考察Table 2 The relative standard deviations investigation of the four organic acids

2.2.3 回收率考察

精確量取樣品適量，在其中精確加入標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，按1.4.2色譜條件進(jìn)樣分析，回收率結(jié)果見表3。回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示該樣品方法可以滿足分析的要求。

表3 回收率考察(n=5)Table 3 The investigation of the recoveries(n=5)

2.3 樣品測(cè)定

精確量取樣品適量，按1.4.1條件處理樣品后，按1.4.2色譜條件測(cè)定樣品中4種有機(jī)酸含量，結(jié)果分別為:酒石酸 0.048 2 mg/mL;乳酸 4.912 5 mg/mL;乙酸0.275 0 mg/mL;富馬酸0.001 7 mg/mL(見表3)，表明漿水中有機(jī)酸以乳酸含量明顯高于其他3種有機(jī)酸的含量為特征。

3 討論

(1)建立了漿水中酒石酸、乳酸、乙酸、富馬酸含量的HPLC測(cè)定方法。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單、快速、可靠。

(2)本試驗(yàn)曾使用依利特C18柱分離漿水中的有機(jī)酸，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4(v∶v=0.5∶99.5)時(shí)各有機(jī)酸分離效果較好，但是流動(dòng)相中水的比例大于80%時(shí)，會(huì)影響C18色譜柱的使用壽命。有文獻(xiàn)報(bào)道［13］，C18色譜柱不適用于分離多種有機(jī)酸。ZORBAX SB-AQ柱通過對(duì)傳統(tǒng)的C18柱改性，具有親水性的表面，用于漿水中有機(jī)酸含量的測(cè)定得到了理想的結(jié)果。

(3)許多緩沖溶液在210 nm處都有吸收，而磷酸緩沖液在210 nm處幾乎無吸收，可作為有機(jī)酸測(cè)定的流動(dòng)相，故本試驗(yàn)選擇KH2PO4作為緩沖液。緩沖溶液濃度越高，酸的存在形式越穩(wěn)定，但當(dāng)緩沖溶液的濃度過高時(shí)，離子強(qiáng)度增大，對(duì)組分分離不利，同時(shí)影響色譜柱的壽命，增加了流動(dòng)相的本底吸收，降低了測(cè)定的靈敏度［14］。本試驗(yàn)分別選擇緩沖液濃度為0.005 mol/L，0.01 mol/L，0.02 mol/L 考察對(duì)樣品分離效果的影響，當(dāng)緩沖液濃度為0.005 mol/L時(shí)，乳酸出現(xiàn)前展現(xiàn)象，當(dāng)緩沖液濃度為0.02 mol/L時(shí)，各有機(jī)酸分離效果和濃度為0.01 mol/L時(shí)相似，但高濃度磷酸鹽會(huì)影響色譜柱壽命，最終確定KH2PO4濃度為0.01 mol/L。

(4)通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值可抑制解離增加保留［15］。本試驗(yàn)用 H3PO4調(diào)節(jié)流動(dòng)相 pH值分別為4.0、3.0和2.0，當(dāng)pH=3時(shí)乳酸出現(xiàn)前展現(xiàn)象且未達(dá)到基線分離，pH=4時(shí)乳酸的峰和前一個(gè)未知酸峰未完全分離，出現(xiàn)遮掩現(xiàn)象，當(dāng)pH=2各有機(jī)酸的分離效果較好。

［1］ 孟憲剛，張麗珂，周鴿鴿.傳統(tǒng)發(fā)酵食品-漿水研究概況及發(fā)展前景展望［J］.食品工業(yè)科技，2010(10):402－404.

［2］ 杜鵬，霍貴成.傳統(tǒng)發(fā)酵食品及其營(yíng)養(yǎng)保健功能［J］.中國(guó)釀造，2004，132(3):6 －8.

［3］ 張軼，王玉麗，陳曉前，等.傳統(tǒng)發(fā)酵食品—漿水中微生物的分離與初步鑒定［J］.食品科學(xué)，2007，28(1):219－222.

［4］ 張麗珂，周鴿鴿，孟憲剛.傳統(tǒng)發(fā)酵食品漿水中厭氧微生物分離鑒定初探［J］.食品科技，2010，35(4):39－41.

［5］ 張宗舟，陳志梅，鞏曉芳.漿水生產(chǎn)過程中的微生物分析［J］.中國(guó)釀造，2009，137(10):29－31.

［6］ 高衛(wèi)衛(wèi)，杜金華，于玲，等.櫻桃酒中有機(jī)酸種類和含量的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(10):145－149.

［7］ 王玉君，李烈英，孫永樂，等.高效液相色譜法分析色酒中有機(jī)酸的研究［J］.色譜，1991，9(4):271－272.

［8］ 丁明玉，陳培榮，羅國(guó)安.食品中有機(jī)酸的高效液相色譜分析法［J］.色譜，1997，15(3):212－214.

［9］ 史春云，田晶，馬延和，等.反相高效液相色譜法測(cè)定嗜堿微生物發(fā)酵液中的有機(jī)酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(4):116－118.

［10］ 呂利華，梁麗絨，趙良啟.山西老陳醋中有機(jī)酸的HPLC測(cè)定分析［J］.食品科學(xué)，2007，28(11):456－459.

［11］ 黃慧敏，張偉國(guó).反相高效液相色譜法測(cè)定蘋果酸發(fā)酵液中的有機(jī)酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(5):180－184.

［12］ 呂旭聰，黃志清，黃若蘭，等.反相高效液相色譜法同時(shí)快速測(cè)定黃酒和葡萄酒中有機(jī)酸的含量［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(6):132－136.

［13］ Suárez-Luque S，Mato I，Jose FH et al.Rapid determination of minority organic acids in honey by high-performance liquid chromatography［J］.J Chromatogr A，2002，955(2):207－214.

［14］ 楊 毅，李崎，陳蘊(yùn)，等.反相高效液相色譜法(RPHPLC)測(cè)定啤酒中有機(jī)酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29(8):6－12.

［15］ 賈洪峰，賀稚非，李洪軍，等.高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵辣椒中的有機(jī)酸［J］.食品科學(xué)，2008，29(3):374－379.