超聲波-LiCl對紅法夫酵母復合的誘變效應*

徐彩榮，閆真真，朱傳合

(山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)

蝦青素是一種非VA源的類胡蘿卜素，具有抗氧化性強、延緩衰老、抗癌等多種生物學功能［1］。目前，蝦青素的生產方法主要有生物發酵、從相關原料中提取、化學合成等方法，其中生物發酵法是最為理想的生產方法。常見的能夠產生蝦青素的微生物主要有雨生紅球藻、粘紅酵母、紅法夫酵母及乳酸分支桿菌等［2］。紅法夫酵母具有異養代謝快、培養時間短及可高密度培養等特點，成為國內外研究的重點。

目前國內外的學者針對紅法夫酵母所采用的誘變育種、原生質體融合等技術均獲得了高產菌種［3－9］。超聲波誘變技術作為一種新型的物理誘變育種技術，不但克服了紫外線誘變易產生光修復問題和化學誘變劑高毒性等缺點，而且具有操作方便、安全、誘變效果好等特點［10－13］，在植物及部分微生物育種方面得到了一定應用。LiCl本身并無誘變作用，但在誘變育種中可與一些誘變因子表現出協同作用。關于超聲波及LiCl同時應用于紅法夫酵母改良中還未見報道。本文旨在研究超聲波-LiCl對紅法夫酵母的復合誘變效應，并采用推理選育原理進行高產菌株篩選。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma TY-I-8)，系紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma ATCC 24202)經過誘變選育的菌種。

1.1.2 培養基

液體種子培養基:葡萄糖20 g，酵母粉3 g，蛋白胨5 g，自來水1 000 mL，pH自然;

搖瓶發酵初始培養基:葡萄糖20 g，酵母粉3 g，蛋白胨5 g，自來水1 000 mL，pH自然;

二苯胺篩選培養基:葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨 20 g，瓊脂 20 g，二苯胺 140 μmol/L，自來水1 000 mL，pH 自然。

1.2 實驗方法

1.2.1 出發菌株生長測定

取活化后斜面種子1環接至盛有30 mL搖瓶發酵培養基的250 mL三角瓶中，20℃，160 r/min振蕩培養48h。然后移取培養液以10%接種量接至另外39個盛有30 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，20℃，160 r/min振蕩培養。每6 h取出3瓶，同時平行測定生物量和蝦青素含量，結果取平均值。24 h后改為每12 h取樣，132 h后結束。

1.2.2 菌懸液的制備

用無菌水洗脫酵母菌種，然后倒入滅過菌的小三角瓶中，在漩渦振蕩器上進行振蕩使菌體分散均勻，用0.85%生理鹽水稀釋到106～108個/mL，即得菌懸液，備用。

1.2.3 誘變處理

1.2.3.1 超聲波誘變劑量的選擇

將菌懸液分裝于5mL規格離心管中，平均每管加樣3 mL。將離心管放在超聲波儀器中，在20 kHz，200 W條件下進行超聲波處理;按離心管編號順序依次處理 8、12、24、30、36、42、48、54、60、66 min;平行 3份誘變處理。處理后的菌液稀釋一定梯度涂平板，并以相同條件下沒有經過超聲波處理的菌液作對照，20℃培養6～7 d后計菌落數，計算致死率和正突變率。

1.2.3.2 LiCl濃度的選擇

將經過超聲波誘變處理適當時間的菌懸液稀釋一定梯度后涂布于含濃度梯度為1、2、3、6、12 g/L的LiCl平板上，同條件下無LiCl的平板培養基為對照樣，20℃培養6～7 d后計菌落數，計算致死率和正突變率。

1.2.4 致死率和正突變率測定

菌株的致死率為其經過超聲波誘變后在平板培養基上長出的菌落數與同條件下未經誘變處理的對照菌株在平板培養基上長出的菌落數的比值。正突變率為蝦青素含量與對照菌株相比提高在5%以上的突變菌株占全部被考察菌株的比例。

1.2.5 二苯胺最適篩選濃度的確定

分別移取適量0.01 mol/L的二苯胺溶液，添加到完全培養基中，制成不同梯度(分別含二苯胺10、20、40、60、80、100、120、140、160 mol/L)的二苯胺平板，每個梯度做3個平行。取0.1 mL稀釋好的菌懸液涂布于上述二苯胺平板上，置于20℃恒溫培養箱中培養4～5 d，待菌落長出后，觀察菌落生長情況，選擇最適二苯胺濃度。

1.3 分析方法

菌體生物量及蝦青素測定:參照zhu等人報道方法［18］。

2 結果與分析

2.1 出發菌株生長特性測定

按照1.2.1的方法測定出發菌株的生長曲線，實驗結果如圖1所示。

從圖1可以看出，搖瓶發酵36 h后酵母生長進入對數生長期，當酵母生長84 h后達到了穩定期，至120 h以后進入衰退期，生物量開始顯著降低。蝦青素的積累在紅法夫酵母生長的初期緩慢地增長，在酵母生長36 h后蝦青素產量開始明顯增大，當發酵到84 h后紅法夫酵母生長進入穩定期，蝦青素產量繼續增加，到120 h后酵母生長進入衰退期，生物量、蝦青素產量隨之降低。

圖1 出發菌株生長曲線Fig.1 The growth curve of original strain

2.2 超聲波對酵母菌株致死率與正突變率的影響

按照1.2.3.1的方法進行超聲波誘變處理，繪制致死率及正突變率曲線，結果如圖2所示。

由圖2中可知，隨著超聲時間的增加，紅法夫酵母菌株的致死率和正突變率逐漸增大，當超聲誘變時間為60 min時致死率為79.3%，正突變率達到最大值為30.5%。據報道致死率在70% ～80%，微生物正向突變率較高［19］。選擇超聲誘變時間為60 min。

圖2 超聲波誘變對菌株致死率及正突變率的影響Fig.2 The death rate and positive rate and positive rate of strain by Ultrasonic

2.3 超聲波-LiCl復合誘變對菌株致死率與正突變率的影響

按照1.2.3.2的方法進行實驗，結果如表1所示。

表1 超聲波-LiCl復合誘變對紅法夫酵母菌株致死率和正突變率的影響Table 1 The effect of death rate and positive rate on Phaffia rhodozyma by Ultrasonic-LiCl

由表1可知，LiCl濃度在1 g/L以下時，對紅法夫酵母致死率沒有明顯影響(P＞0.05)，當LiCl濃度在2～12 g/L時，紅法夫酵母的致死率隨著LiCl濃度的提高而提高。正突變率隨著LiCl濃度的升高出現先升高后降低的趨勢。總的來說，復合誘變效果較好，LiCl在一定濃度范圍內能顯著提高正突變率。由表1可知，隨著LiCl濃度的增加酵母菌落逐漸變小，細胞顏色逐漸變淺，菌落之間差異明顯。本實驗選取2 g/LLiCl濃度與超聲波進行復合誘變。

2.4 蝦青素高產菌株的篩選

2.4.1 二苯胺篩選劑量的選擇

本實驗研究了不同二苯胺濃度下紅法夫酵母菌株的生長狀況，其結果如表2所示。

表2 酵母菌株二苯胺抗性實驗Table 2 Resistance test about diphenylamine of Phaffia rhodozyma

由表2可以看出，二苯胺濃度為10 μmol/L時菌落生長無明顯變化，當二苯胺濃度為60～120 μmol/L時菌落顏色變成淺紅色和白色，當二苯胺濃度為140 μmol/L時，菌落全部變成白色、菌落小、生長慢，濃度達到160 μmol/L時長時間培養后仍無菌落生長，因此，選擇二苯胺篩選濃度為140 μmol/L。

2.4.2 高產菌株的篩選

將超聲誘變60 min后的菌懸液適當稀釋后涂布到含2g/LLiCl的平板培養基上，待菌落長出后，挑選出菌落大、顏色紅而油亮的菌株1 627株，轉接到含二苯胺(140 μmol/L)的斜面培養基中，20℃培養6～7 d后選取生長快、顏色亮而紅的菌株453株進行搖瓶發酵，測定蝦青素含量和生物量。選取生物量和蝦青素含量高于出發菌株25%的突變株119株進行復篩，測定生物量和蝦青素含量，測定3次取平均值，部分結果見表3。

表3 超聲波-LiCl復合誘變二苯胺篩選的復篩結果Table 3 The results of second screening about Ultrasonic-LiCl Mutagenic and diphenylamine screening

由表3可知，經過超聲波-LiCl復合誘變處理后，紅法夫酵母合成蝦青素的水平得到有效提高，部分誘變株的生物量和蝦青素含量較突變株均有不同程度的提高。

2.5 高產菌株遺傳穩定性試驗

根據復篩結果選取蝦青素含量比較高的前五株菌株 UL－1、UL－2、UL－3、UL－4、UL－5，進行高產菌株的遺傳穩定性試驗，測定菌株的蝦青素含量，測定3次取平均值，結果見表4。

表4 高產菌株遺傳穩定性結果Table 4 The high-yield strain genetic stability test

由表4可知，菌株 UL－1、UL－4、UL－5經過傳代后，蝦青素含量有所下降，而菌株UL－2、UL－3顯示出較好的遺傳穩定性。UL－2的生物量和蝦青素含量最高，分別為8.52 g/L和856.72 μg/g，比出發菌株分別提高了95.86%和289.42%，蝦青素產量高達 7 299.25 μg/L。

3 結論

(1)研究了不同超聲處理時間對紅發夫酵母菌株存活率及正突變率的影響，結果表明，隨著超聲時間的延長，酵母菌株的致死率及正突變率逐漸升高，當超聲誘變時間為60 min時，正突變率達到最大值為30.5%。超聲波-LiCl復合誘變效應表明，LiCl在一定濃度范圍內能顯著提高正突變率，復合誘變效果明顯。

(2)采用超聲波60 min及LiCl 2 g/L進行復合誘變，并選擇二苯胺進行推理選育，最終篩選出1株遺傳性能穩定的蝦青素高產菌株UL－2，其生物量和蝦青素含量分別比出發菌株提高了95.86%和289.42%。

(3)本研究首次將超聲波-LiCl復合誘變技術、二苯胺推理選育技術應用到高產蝦青素紅發夫酵母菌株的選育中。研究證實超聲波-LiCl復合誘變技術可以有效進行紅法夫酵母菌株改良;二苯胺能對突變型菌株進行濃縮，提高菌種的篩選效率。

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