1株高產凝乳酶菌株的鑒定及N+注入誘變選育*

洪豐，王志耕，梅林，薛秀恒

(安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽省農產品加工工程實驗室，安徽省乳品工程技術研究中心，安徽合肥，230036)

干酪生產中應用的凝乳酶主要有3類［1］，包括動物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶，評價凝乳酶優劣的兩個重要指標是凝乳活力和蛋白水解力。近年來，由于世界干酪產量逐年上升，對凝乳酶的需求也不斷增大，因此，來源廣泛、價格低廉的微生物凝乳酶日益受到人們的重視［2］。

從自然界篩選出的天然菌株產酶能力一般不高，通過誘變選育是提高野生菌株產酶水平的有效途徑之一［3］。由于離子束獨特的生物學效應，低能離子通過加速器注入生物體內獲得加速，以動量、質量、能量和電荷共同作用于生物體細胞，在與生物體作用過程中，與生物體的分子、原子發生一系列的碰撞，產生突變，在輻照微生物育種過程中經常表現出獨特的優勢［4－5］。離子束誘變育種與傳統的化學和輻射誘變法相比，具有損傷輕、正突變率高、突變譜廣、遺傳穩定、易于獲得理想菌種等優點，是菌種選育的較理想方法［6］。

目前關于產凝乳酶菌株的誘變選育研究大多集中在霉菌和真菌，對細菌的報道較少。本研究以市售干酪為原料，從中分離出1株產凝乳酶的菌株，采用生理生化特征分析和16S rDNA序列分析的方法對菌株進行鑒定，在此基礎之上首次采用低能氮離子束注入法對該種產凝乳酶細菌進行誘變，探究離子注入的最佳條件，篩選高產凝乳酶株系，以期為細菌凝乳酶的工業化發酵生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

菌株分離樣品來源于市售Mainland Edam Cheese(美蘭契達干酪)。

1.1.2 試劑和儀器

酪蛋白(高純級95%)，美國AMRESCO公司;微量生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司;Taq酶等PCR反應試劑，上海生工生物工程有限公司;DNA提取試劑盒及凝膠回收試劑盒，北京天根;其他試劑均為分析純。

DHP060型恒溫培養箱，上海實驗儀器廠有限公司;PHS－3B精密pH計，上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠;SW－CJ－1F無菌操作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;IX51倒置式基礎型顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社;Allegra 64R Centrifuge，美國BECKMAN COULTER公司;PCR擴增儀，杭州朗基科學儀器有限公司;培清JS－680D全自動凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司;離子注入機，中國科學院等離子體物理研究所。

1.1.3 培養基

酪蛋白平板培養基:酪蛋白10 g、牛肉膏3 g、Na2HPO42 g、NaCl 5 g、瓊脂 15 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 7.4。

發酵培養基:酪蛋白10 g、牛肉膏3 g、葡萄糖10 g、Na2HPO42 g、NaCl 5 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 7.4。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液的制備

在發酵培養基上按2%的比例接種菌液，37℃下120 r/min培養48 h，6 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。

1.2.2 凝乳活力測定方法［7］

Arima方法:取5 mL 100 g/L的脫脂乳，35℃保溫5 min，加入0.5 mL的發酵液，于旋渦混合器上混合，準確記錄從加入酶液到乳凝固時間(min)。

1個索氏單位(SU):40 min凝固1 mL 100 g/L的脫脂乳的酶量。

式中:T為凝乳時間;D為酶液稀釋倍數。

1.2.3 蛋白水解活力測定方法［8］

取5 mL 1.2%酪素溶液，加1 mL稀釋10倍后的酶液，35℃保溫10 min，用5 mL 0.44 mol/L三氯醋酸終止酶反應，繼續保溫20 min，反應混合物用濾紙過濾。取濾液2 mL，加0.55 mol/L Na2CO3溶液5 mL后再加0.7 mol/L的Folin試劑1 mL，35℃保溫20 min，于660 nm波長處測量吸光度值。

式中:A為660 nm波長處吸光度值;K為標準曲線中光吸收為“1”時的酪氨酸量(μg/μg);V為酶促反應的總體積/mL;t為酶促反應時間/min;N為酶的稀釋倍數。

1.2.4 菌株的篩選

初篩:稱取奶酪5 g，迅速倒入帶玻璃珠的45 mL無菌水三角瓶中振蕩30 min，即成為10－1的懸浮液。將懸浮液梯度稀釋后涂布到酪蛋白平板上37℃培養48 h。從平板上挑取周圍有凝乳圈的單菌落劃線分離直至純培養。

復篩:將純培養物接種到發酵培養基中37℃下120 r/min振蕩培養48 h。將發酵液6 000 r/min離心10 min，取其上清液測定凝乳活力，篩選出凝乳活力高的菌株。

1.2.5 菌株的鑒定

生理生化特征分析:對分離純化的菌株依據《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》提供的方法進行生理生化特征分析鑒定［9－10］。

16S rDNA同源性序列分析:用試劑盒提取菌株的基因組 DNA，采用通用引物(正向引物27f:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物1492r:5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3')對菌株基因組進行16S rDNA擴增。PCR反應體系(50 μL):模板(約30 ng/μL)2 μL，dNTP(脫氧核苷三磷酸)1 μg，各 2.5 mmol/L，緩沖液 5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各 1 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，去離子水39.5 μL。PCR反應條件:94℃預變性3 min，94℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 90 s，30 個循環，72 ℃再保溫10 min，保存于4℃。PCR產物經純化后送交上海生工生物工程有限公司測序并與GenBank(美國國家生物信息中心)中的相關屬種進行比對，利用Clustal X 1.83和MEGA 5.0軟件并采用Neighbor-Joining(鄰接法)方法構建系統進化樹和Bootstrap analysis(自舉法)方法進行1 000次重復抽樣分析。

1.2.6 樣品處理與 N+注入［11－12］

以培養24 h的菌液稀釋1 000倍，取0.15 mL均勻涂布于無菌平皿上，用無菌風吹干。取鏡檢無細胞重疊者進行N+注入，注入能量選定為20 keV，注入劑量為0、1、2、3、4、5 × (0.52 ×1015ions/cm2)，靶室真空度為10－3Pa，離子注入每個劑量和能量是相對于該劑量和能量只接受相同時間的真空處理而言。將平皿置于水冷靶臺上，以5 s脈沖式注入，間隔55 s，然后取出平皿，以2 mL無菌水洗脫，涂布于酪蛋白平板，37℃培養3 d用于單菌落的挑選和存活率的計算。

1.2.7 存活率和正突變率的計算

存活率是指試驗組平皿中的菌落平均數與對照組平皿中的菌落數之比。經離子注入后的樣品，每皿用2 mL無菌水洗下，每個稀釋度取0.2 mL涂布于初篩培養基，37℃恒溫培養48 h后，統計存活細胞數A。未經處理的對照組平皿同條件培養后統計存活細胞數B。A和B的比值即為存活率。

式中:A為實驗組存活細胞數;B為對照組存活細胞數。

取經輻照處理后的單菌落分別進行發酵實驗，同時以出發菌株為對照，考察菌株凝乳活力。凝乳活力比出發菌株高5%以上為正突變菌株。

1.2.8 誘變菌株的選育

從酪蛋白平板上挑選凝乳圈較大且透明圈較小的誘變菌株，進行發酵復篩。測定各菌株的凝乳活力、蛋白水解活力及凝乳效果，篩選出凝乳活力高、蛋白水解活力小及凝乳效果良好的菌株。

1.2.9 遺傳穩定性實驗及數據處理

進行遺傳穩定性試驗，將篩選得到的誘變菌株連續6代斜面轉接、活化，并接種于發酵培養基培養，測定發酵液凝乳活力，每支斜面6個重復，所得結果取平均值。采用統計分析軟件SPSS 18.0對遺傳穩定性試驗數據進行分析，試驗結果以mean±SD表示，具有穩定遺傳的菌株即為目的菌株。

2 結果與分析

經過初篩和復篩共得到5株純培養物(見表1)。各菌在酪蛋白平板上均能生長，在菌落周圍有凝乳圈。由表1可知，5株測試菌株在凝乳活力、蛋白水解活力、酶活比值(凝乳活力/蛋白水解活力)指標及凝乳效果上均存在差異，選取凝乳活力高、蛋白水解活力低、酶活比值高、凝乳效果良好的XC－1菌株作為后續研究及誘變出發菌株。

2.1 產凝乳酶菌株的分離純化篩選

表1 菌株篩選結果Table 1 Screening results of the strains

2.2 XC－1菌株生理生化鑒定

XC－1菌株生理生化指標鑒定結果見表2，顯示其生物學特征與枯草芽孢桿菌屬的主要指標相符合，初步判定該菌株為Bacillus subtilis。

表2 XC－1菌株的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characters of XC－1 strain

2.3 XC－1菌株的16S rDNA PCR擴增和序列分析

2.3.1 XC－1菌株的16S rDNA PCR擴增(圖1)

圖1 XC－1菌株16S rDNAPCR擴增片段Fig.1 The PCR fragment of 16S rDNA of strain XC－1

用抽提的XC－1菌株DNA為模板進行PCR擴增，獲得了一條大小約為1.5 kb特異的預期條帶。獲得的特異片段經純化后測序，得到1 452 bp序列片段，其在GenBank上的登錄號為KC492497。2.3.2 XC－1菌株系統進化樹的構建(圖2)

圖2 XC－1與相關菌株的系統進化關系Fig.2 Phylogenetic tree of XC－1 based on the 16S rDNA sequences

將得到的序列與GenBank核酸序列庫中的序列進行BLASTn(局部同源性比較)，結果表明，XC－1菌株與Bacillus subtilis的16S rDNA序列有較高的同源性，其中與Bacillus subtilis(NR027552)有99%的同源性。參考XC－1細菌16S rDNA在GenBank的比較結果，利用Clustal X1.83和MEGA5.0軟件構建系統發育樹。系統進化樹顯示，菌株XC-1與Bacillus subtilis(NR027552)構成一個分支。細菌分類學家普遍認為，當16S rDNA序列同源性高于97%，可以認為是屬內的同種，低于95%，則可能為屬外成員［13］。因此，可確定菌株XC－1為Bacillus subtilis。

2.4 N+注入對XC－1菌株的誘變效應

XC－1菌株經N+注入處理后的存活率和正突變率如圖3所示。圖3顯示在同一能量場作用下，注入劑量在0～1.04×1015ions/cm2之間時，隨著注入劑量的增大，XC－1菌株的存活率明顯下降，注入劑量在1.04×1015～2.08×1015ions/cm2時存活率逐漸回升。

N+注入誘變的突變頻率與離子注入的劑量和能量有很大的相關性。當XC－1菌株誘變存活率在20%～30%時能達到最高的正突變率。圖4顯示在能量為20 keV，劑量為2.08×1015ions/cm2時正突變率最高，達到27.2%，隨后正突變率又逐漸降低。

圖3 N+輻照的存活率和正突變率曲線Fig.3 Curves for the survival rate and positive mutation of strain irradiated by N+

綜合考慮菌株的存活率和正突變率，確立最佳誘變劑量值為2.08×1015ions/cm2。這個獲得較高正突變率的注入劑量范圍對應在存活率25%左右的區間，這可能是由于在此劑量范圍內菌體細胞受到的能量、動量沉積和電荷交換等誘變因素最為豐富，能產生更廣的誘變譜［14］。

2.5 誘變菌株的選育

2.5.1 誘變菌株的篩選

誘變菌株的部分篩選結果見表3。觀察發現，XCYB－6菌株的凝乳活力最高為2 181.82 SU/mL，比出發菌株提高65.63%，同時，其蛋白水解活力最低(2.53 U/mL)，酶活比值最高(862.38)，該菌株的凝乳效果表現良好:凝乳時間最短，凝乳氣味良好，質地光滑，硬度適中，均勻有光澤呈乳黃色。因此，選擇XCYB－6菌株為誘變選育目的菌株。

表3 氮離子束誘變菌株特性Table 3 Nitrogen ion beam mutant strains features

2.5.2 誘變菌株遺傳穩定性檢驗

遺傳穩定性實驗和方差分析結果見表4。由表4可知誘變后篩選得到的XCYB－6菌株傳至第6代，凝乳活力穩定在2 182.11～2 182.82 SU/mL之間。突變菌株XCYB－6凝乳活力6代間差異不顯著(P＞0.05)，表明誘變菌株具有很好的遺傳穩定性，其性狀可以得到穩定遺傳。

表4 誘變菌株XCYB－6不同代次的凝乳活力Table 4 Milk-clotting enzyme activity of mutant XCYB－6 of different generation

3 結論

N+束誘變處理可顯著提高枯草芽孢桿菌菌屬產凝乳酶的活力，最佳離子注入誘變條件為:能量20 keV、劑量2.08 ×1015ions/cm2。

本研究獲得1株可用于凝乳酶生產誘變菌株，其凝乳活力為2 181.82 SU/mL(比出發菌株提高65.63%)，蛋白水解活力為2.53 U/mL，遺傳穩定性良好。

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