生物分離工程綜合實驗的設計

趙東旭，羅愛芹，李 春，張建麗，周曉宏，楊新芳

在高等教育過程中，實驗教學對于促使學生加強對書本知識的理解、掌握基本的實驗設計方法和操作技能、增強感性認識、貫徹系統性實踐的能力等，具有不可替代的作用，應該受到更多的重視，加強新型交叉學科生物工程專業學生的實踐創新能力更是迫在眉睫［1－2］。生物分離工程課程是生物工程專業的必修基礎課程，生物分離工程的實驗環節不同于傳統的化工分離操作，其在上游生物工程、發酵技術的基礎上，從濃度稀、成分復雜、物料不穩定的料液開始操作，整個生物分離過程包括材料預處理和固液分離、初步純化、高度精制和成品制作四大單元操作。分離工藝經過不同批次的條件摸索后，即可用于放大生產。生物分離過程集現代生命科學和工程設計學為一體，重復性強、步驟多、交叉性明顯、應用性強。

1 現代生物分離工程綜合性實驗設計的必要性

生物工程已經作為一級學科列入國務院學位辦下發的學科目錄，表明現代生物技術在國民經濟建設中的作用愈來愈受到重視。生物分離工程（有時也稱作生化分離工程，bio－separation）是生化工程的一個重要組成部分，它是描述回收生物產品分離過程原理和方法的一個術語。生化分離工程是生物技術轉化為生產力所不可缺少的重要環節，為突出其在生物技術領域中的地位和作用，常稱它為生物技術下游加工過程（down－stream processing）。傳統上的生物分離工程是作為生物工程或生物技術進入實際應用的必須后續技術之一。最新的發展趨勢表明，生物分離工程或將作為現代生物工程的重要研究方向之一，與“細胞培養與代謝工程”、“生物催化與轉化工程”、“合成生物技術與系統生物工程”、“生物藥物與材料工程”、“生物資源與環境工程”等共同發展。作為重要的工科課程，同時也作為生物工程專業的重要基礎課程，關于其理論課的教學探討已有較多的討論［3－6］，甚至有學者提出了“研究型”教學的模式［7－8］，但是在其實踐環節的綜合性實驗方面的討論還有待深入。生物分離工程實驗教學是整個教學計劃中的有機部分，它具有鞏固和加深學生所學的理論知識，使學生獲得生產知識、培養學生實際工作能力的功能。學生動手能力的培養不在于一定要發現新的生物分離技術，爭創專利，而是學生在現有的知識、能力的基礎上，能夠創造性地解決問題［9－10］。為提高學生的綜合性、工程性創新能力，有必要將相對分散的課程體系提煉出一個系統性強的綜合性實驗體系，同時也是強化與改革現有的實踐教學環節的具體體現。本文將以天花粉蛋白的提取和純化過程為例，根據現代生物工程的學科特點和實際生產過程中的單元操作安排，設計出從原料提取到純度鑒定的實驗框架。

2 現代生物分離工程設計的理念

現代生物分離工程涉及到很多的分離技術，在設計理念上應該堅持以下原則：

（1）體現系統性。以某一蛋白為模型蛋白，內容包括原材料的預處理技術、破碎技術、初步提取技術、高度純化（精制）技術、純度鑒定技術等內容。

（2）工程性。將全部的實驗操作完全按照工業生產的單元操作進行劃分，分成若干個工藝段。

（3）目標產物明顯。通過制得一定量的產物來體現所用的分離技術的可行性，同時也可以提升學生的“成就感”和興趣。

目前，以水溶性蛋白或酶為目標蛋白的制備過程，是生命科學實驗室中最為常見的操作，其中基本上全部用到了最為常見的分離技術，如針對動植物組織的組織破碎或高壓壓榨技術，實現液固分離的離心技術、過濾技術，可對大體積樣品進行快速濃縮并且有初步純化作用的鹽析技術和吸附技術，可對樣品進行高度純化的各種層析技術等。離子交換層析是一種特殊的吸附層析，基本上是一種必不可少的手段。對于蛋白純度檢測來說，尺寸排阻層析和SDS－PAGE（SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳）是2種最為普遍的手段。對終產品的加工技術主要包括超濾濃縮、冷凍干燥技術等。因此，在綜合性分離工程實驗設計上，應該包括上述全部技術，或至少是絕大部分技術。本文將以傳統中藥天花粉蛋白為模型蛋白，設計其分離純化的技術路線。

3 以天花粉蛋白為模型的綜合性生物分離工程的實驗設計及應用

天花粉是一種傳統中藥，來自于栝樓的塊根，傳統上一般用于終止妊娠反應。研究表明，其生物學活性物質是其含有的天花粉蛋白，而且，最近的研究表明，天花粉蛋白具有明顯的抗腫瘤作用。該蛋白分子量27kD，pI9.4（pI即等電點，絕大多數蛋白的pI在pH 5.0～9.0范圍內）。本文將根據上述原則，以天花粉為原料，提出對其中富含的天花粉蛋白進行提取、分離和純度鑒定的實驗框架［11－13］。

3.1 操作單元1：原料處理

主要操作包括：

（1）原材料的預處理；

（2）天花粉的粉碎及效果評價；

（3）活性炭吸附（脫色處理）。

在原料預處理環節，主要實驗內容包括：去除粘附在塊根上的泥土、清洗、晾干、去皮及稱重、粉碎機（或勻漿機）的多次破碎、大容量低速離心機沉淀未徹底破碎的組織及淀粉粒等、高速冷凍離心機實現較徹底的固液分離以得到真溶液（提取液）、活性炭吸附以脫去色素成分、分光光度計比色方法初步評判破碎效果和所需破碎次數。

需要探索的技術參數包括：

（1）原料與提取液的比例；

（2）破碎次數；

（3）1g活性炭吸附提取液的量或100g原料所需活性炭量（g）；

（4）吸附過程的流速等。

3.2 操作單元2：初步純化

主要操作包括：

（1）合適鹽析條件的確定；

（2）大量提取液的處理——鹽析技術；

（3）透析脫鹽方法；

（4）凍干處理方法。

在初步純化環節，主要實驗內容包括：利用小體積溶液進行硫酸銨20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%飽和度鹽析并配合SDS－PAGE檢測，確定鹽析技術對天花粉蛋白的初步純化，同時為實現對大體積提取液的濃縮摸索條件；大量提取液的鹽析操作、低溫透析操作及凍干操作，以便對高含量比的混合物進行較長時間保存、SDS－PAGE操作。

需要探索的技術參數包括：

（1）合適鹽析范圍，既保證最大限度地去除雜質，又可在最低鹽用量時回收最多的目標蛋白；

（2）比較理想的PAG濃度，以得到理想的電泳圖。

3.3 操作單元3：高度純化（精制）

主要操作包括：

（1）pH階段梯度洗脫方式的陽離子交換層析；

（2）鹽離子線性梯度洗脫方式的陽離子交換層析；

（3）飽和進樣時的階段梯度洗脫方式的陽離子交換層析；

（4）尺寸排阻層析進一步純化天花粉蛋白。

在高度純化（精制）環節，主要實驗內容包括：根據天花粉蛋白在中性pH條件下帶正電荷的性質，在pH 8時進行吸附，可將大部分雜蛋白去除，改變pH再去除pI低于9.4的一些雜蛋白，再用高pH緩沖液洗脫即可得到較純的目標蛋白溶液。充分使用了目標蛋白pI為9.4的特點。鹽離子線性梯度洗脫方式也是一種最為普通的洗脫方式，常用的鹽離子濃度范圍一般是0～0.5mol/L NaCl。常用的梯度儀有2個形狀完全相同，且底部有細管道相連的同水平放置的容器組成，高效液相層析系統則由電腦控制的柱塞泵組成，精確度更高。飽和進樣操作也是一種基本操作，可以高效利用層析系統。尺寸排阻層析既是一種最后的純化手段，也是一種純度鑒定技術，操作過程相對簡單些。

需要探索的技術參數包括：

（1）合適的pH梯度；

（2）在給定層析柱條件下，鹽梯度洗脫時的體積及洗脫速度；

（3）尺寸排阻層析的進樣量及洗脫速度等。

3.4 操作單元4：成品加工

主要操作包括：

（1）超濾濃縮；

（2）冰凍干燥處理。

在對末端產物的加工環節，主要實驗內容包括：

（1）利用超濾濃縮技術對大體積的含有目標產物的溶液進行濃縮，達到合適的濃度；

（2）利用冰凍干燥機對上述樣品進行凍干并分裝保存。

需要探索的技術參數包括：

（1）在選定截留一定分子量蛋白的超濾后，探索合適的過膜壓力和濃縮倍數；

（2）在給定容器和樣品體積條件下，探索凍干所需的大致時間。

3.5 操作單元5：純度鑒定

主要操作包括：

（1）分析型尺寸排阻層析技術；

（2）SDS－PAGE方法。

在純度鑒定環節，主要實驗內容包括：

（1）分析性尺寸排阻層析對目標樣品的分析，根據出峰情況初步斷定樣品的純度，該操作需要用到高效液相層析系統；

（2）利用SDS－PAGE方法檢測樣品中蛋白單體/亞基的組成，該操作是普通生物化學實驗室里的常規操作，通過與分析性尺寸排阻層析的比較來斷定樣品的純度。

需要探索的技術參數包括：

（1）給定尺寸排阻層析柱時，不同的流動相的選擇以及進樣體積的范圍；

（2）SDS－PAGE操作時，合適的凝膠濃度。

根據上述操作，需要得到的結果匯總到簡表（表1）中，以指示實驗進度。

表1 不同操作環節的蛋白回收情況比較（空白表）

3.6 應用

我們將上述實驗設計的內容作為我校2010級和2011級研究生課程“高等生物分離工程”的實驗部分，選課學生包括“化學工程與技術”學科及“生物學”學科的100多位碩士研究生（含少量博士生），加深了學生對現代生物分離工程系統性、工程性的認識，取得了預期的訓練效果。

4 結束語

通過生物分離工程綜合性實驗的設計和在我校2010級和2011級相關專業研究生的具體實踐，達到了我們的預期目標，同時在實踐中也對具體的實驗過程進行了完善。這項工作的進一步改進，將會更加有利于生物工程類研究生（含本科生）的教育教學。

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