ThIPK2基因植物表達載體的構建

重點實驗室/小麥玉米國家工程實驗室，山東濟南250100）

摘要：為培育高度抗逆和無選擇標記的轉基因小麥，本研究從NCBI數據庫中搜索到ThIPK2基因序列，依據該基因編碼的氨基酸序列，參照小麥偏愛的密碼子對該基因進行密碼子優(yōu)化，并將重復的和不必要的酶切位點去掉后進行人工合成。將改造后的ThIPK2基因插入到強啟動子Ubiquitin和終止子AtSac66之間，然后將其插入到含有玉米Ac/Ds轉座子背景骨架的植物表達載體中，獲得了具有刪除選擇標記功能的、由玉米Ubiquitin啟動子驅動ThIPK2基因的植物表達載體。經過限制性內切酶分析鑒定，該植物表達載體構建成功。

關鍵詞：ThIPK2基因；密碼子優(yōu)化；表達載體構建

中圖分類號：Q786文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）05-0018-06

小麥是世界上分布最廣、種植面積最大的糧食作物之一。隨著人口增多和自然環(huán)境的不斷惡化、水資源短缺以及土壤鹽堿化，培育抗逆小麥品種已成為當務之急。傳統(tǒng)的小麥育種主要利用品種間雜交，而基因工程技術的發(fā)展和應用，打破了物種間基因流動的限制，將外源基因導入小麥細胞并獲得轉基因植株，為小麥育種開辟了新途徑，對提高小麥耐鹽抗旱性具有重要的戰(zhàn)略意義。

磷脂酰肌醇信號傳導途徑在植物生長發(fā)育和感受刺激并對之應答的過程中發(fā)揮十分重要的作用。多磷酸肌醇激酶/三磷酸肌醇3激酶（inositol polyphosphate kinase/inositol 1，4，5-trisphosphate 3-kinase， IPK2/IP3K）是該信號途徑中的一個關鍵酶，磷酸化IP3成為1，3，4，5-四磷酸肌醇（inositol 1，3，4，5-tetrakisphosphate， IP4）和1，3，4，5，6-五磷酸肌醇（1，3，4，5，6-pentakisphospate， IP5），IP4能夠與IP3協同作用調節(jié)胞外鈣離子入膜和維持細胞內鈣離子平衡。因此，IPK2在協調IP3和IP4水平、維持鈣離子穩(wěn)態(tài)過程中起關鍵作用，參與了多種生理過程的調控。有研究報道，IPK2與植物對鹽脅迫等非生物脅迫的應答有關。例如Yang等[1]的研究表明，IPK2具有增強轉基因煙草耐受高鹽脅迫和滲透脅迫的能力。Zhu等[2]從鹽芥（Thellungiella halophila）克隆基因ThIPK2，并將該基因轉化到油菜（Brassica napus L cv）滬油1號中，結果表明轉ThIPK2基因油菜植株表現出較強抗鹽、抗旱和抗氧化的特點。進一步的研究表明，在轉基因油菜中，ThIPK2基因的表達能提高脅迫應答基因的轉錄和改善脂肪酸的組成；在鹽脅迫下轉ThIPK2具有提高植物抗干旱和耐低溫脅迫的能力。在上述研究的基礎上，本工作準備利用ThIPK2基因通過轉基因技術對小麥的抗逆性進行遺傳改良。

另外，遺傳密碼子有64種，但絕大多數生物傾向于利用這些密碼子中的一部分，表現出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。利用偏愛密碼子避免利用率低的或稀有的密碼子稱為密碼子優(yōu)化。為了提高目的基因ThIPK2的表達量，本研究根據小麥的偏愛性密碼子對該基因進行了密碼子優(yōu)化。

有效的篩選標記基因對于轉基因植物的獲得至關重要，目前常用的標記基因如新霉素磷酸轉移酶（neomycin phosphotransferaseⅡ）NPTⅡ基因、潮霉素磷酸轉移酶（hygromycin phosphotransferase）HPT基因等抗生素抗性基因及膦絲菌素乙酰轉移酶（phosphinothricin acetyltransferase）Bar基因、乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase）ALS基因等。但這些標記基因滯留在植物體內并持久表達不僅會給植物生長帶來負擔，而且還會給其他有利性狀基因的表達帶來一定的影響，因此它們的使用也引發(fā)了人們對轉基因安全性的隱憂[3～6]。為了解決這些弊端，獲取無選擇標記的轉基因植物，應運而生了玉米的Ac/Ds轉座子系統(tǒng)，該系統(tǒng)作為無選擇標記基因的載體，利用了Ds元件能從染色體的一個位點轉移到另一個位點的特性，再通過后代重組自交與原初位點上的標記基因及Ac元件分離，進而得到只含有Ds元件的轉基因植株。該系統(tǒng)已經被應用于多種異源植物如轉基因番茄[7]、煙草[8]、水稻[9]、油菜[10]中并取得成功。

本研究利用DNA重組技術，構建了一個含有密碼子優(yōu)化后的ThIPK2基因、強啟動子Ubiquitin及Ac/Ds轉座子的植物表達載體。該載體可進一步用于小麥的遺傳轉化，以期獲得高抗逆性及無選擇標記基因的轉基因小麥植株。

1材料與方法

11材料

111質粒和菌株載體pBluescript SK、pBIOS1487、pBIOS645和pBIOS1717由本實驗室保存。大腸桿菌DH5α購自全式金公司。

112藥品及試劑高保真酶 Fast-pfu購自全式金公司；限制性內切酶EcoR Ⅴ、SalⅠ、SmaⅠ和NcoⅠ購自Fermentas公司；SalⅠ和PmeⅠ購自NEB（New England Biolabs）公司；DNA片段回收試劑盒購自Axygen公司；T4連接酶購自NEB公司；測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

12載體的構建

121ThIPK2基因的密碼子優(yōu)化從NCBI網站上獲得ThIPK2基因序列和蛋白序列，根據野生型ThIPK2基因及蛋白的序列，參考小麥偏愛的密碼子，將重復的和不必要的酶切位點去掉，并兼顧優(yōu)化后低水平的GC含量，對ThIPK2基因進行密碼子優(yōu)化。

122載體PSAA001的構建合成優(yōu)化好的ThIPK2基因序列（synZPK2）并連接到載體pBluescript SK，然后通過測序的方式鑒定目的序列的插入方向，完成載體PSAA001的構建。這一步由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，流程圖中未列出。

123載體PSAA002的構建用SalⅠ和NcoⅠ雙酶切載體PSAA001和pBIOS1487，將目的片段Ubiquitin啟動子連接到PSAA001 ThIPK2基因的上游，轉化Ecoli，對重組質粒進行酶切檢測。

124載體PSAA003的構建SalⅠ和SmaⅠ雙酶切載體PSAA002，用SalⅠ和EcoRⅤ雙酶切載體pBIOS645，將目的片段AtSac66終止子連接到PSAA002 ThIPK2基因的下游，轉化Ecoli，對重組質粒進行酶切檢測。因為SmaⅠ和EcoRⅤ這兩種酶都是平末端限制性內切酶，酶切后產生的都是平末端，可以用T4連接酶進行連接。

125載體PSAA004的構建用SalⅠ和PmeⅠ雙酶切載體PSAA003和pBIOS1717，將上下游分別連接有啟動子和終止子的ThIPK2基因序列連接到植物表達載體骨架上，轉化Ecoli，對重組質粒進行酶切檢測。