ThIPK2基因植物表達載體的構(gòu)建

重點實驗室/小麥玉米國家工程實驗室，山東濟南250100）

摘要：為培育高度抗逆和無選擇標記的轉(zhuǎn)基因小麥，本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到ThIPK2基因序列，依據(jù)該基因編碼的氨基酸序列，參照小麥偏愛的密碼子對該基因進行密碼子優(yōu)化，并將重復(fù)的和不必要的酶切位點去掉后進行人工合成。將改造后的ThIPK2基因插入到強啟動子Ubiquitin和終止子AtSac66之間，然后將其插入到含有玉米Ac/Ds轉(zhuǎn)座子背景骨架的植物表達載體中，獲得了具有刪除選擇標記功能的、由玉米Ubiquitin啟動子驅(qū)動ThIPK2基因的植物表達載體。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶分析鑒定，該植物表達載體構(gòu)建成功。

關(guān)鍵詞：ThIPK2基因；密碼子優(yōu)化；表達載體構(gòu)建

中圖分類號：Q786文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）05-0018-06

小麥是世界上分布最廣、種植面積最大的糧食作物之一。隨著人口增多和自然環(huán)境的不斷惡化、水資源短缺以及土壤鹽堿化，培育抗逆小麥品種已成為當務(wù)之急。傳統(tǒng)的小麥育種主要利用品種間雜交，而基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，打破了物種間基因流動的限制，將外源基因?qū)胄←溂毎@得轉(zhuǎn)基因植株，為小麥育種開辟了新途徑，對提高小麥耐鹽抗旱性具有重要的戰(zhàn)略意義。

磷脂酰肌醇信號傳導(dǎo)途徑在植物生長發(fā)育和感受刺激并對之應(yīng)答的過程中發(fā)揮十分重要的作用。多磷酸肌醇激酶/三磷酸肌醇3激酶（inositol polyphosphate kinase/inositol 1，4，5-trisphosphate 3-kinase， IPK2/IP3K）是該信號途徑中的一個關(guān)鍵酶，磷酸化IP3成為1，3，4，5-四磷酸肌醇（inositol 1，3，4，5-tetrakisphosphate， IP4）和1，3，4，5，6-五磷酸肌醇（1，3，4，5，6-pentakisphospate， IP5），IP4能夠與IP3協(xié)同作用調(diào)節(jié)胞外鈣離子入膜和維持細胞內(nèi)鈣離子平衡。因此，IPK2在協(xié)調(diào)IP3和IP4水平、維持鈣離子穩(wěn)態(tài)過程中起關(guān)鍵作用，參與了多種生理過程的調(diào)控。有研究報道，IPK2與植物對鹽脅迫等非生物脅迫的應(yīng)答有關(guān)。例如Yang等[1]的研究表明，IPK2具有增強轉(zhuǎn)基因煙草耐受高鹽脅迫和滲透脅迫的能力。Zhu等[2]從鹽芥（Thellungiella halophila）克隆基因ThIPK2，并將該基因轉(zhuǎn)化到油菜（Brassica napus L cv）滬油1號中，結(jié)果表明轉(zhuǎn)ThIPK2基因油菜植株表現(xiàn)出較強抗鹽、抗旱和抗氧化的特點。進一步的研究表明，在轉(zhuǎn)基因油菜中，ThIPK2基因的表達能提高脅迫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄和改善脂肪酸的組成；在鹽脅迫下轉(zhuǎn)ThIPK2具有提高植物抗干旱和耐低溫脅迫的能力。在上述研究的基礎(chǔ)上，本工作準備利用ThIPK2基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對小麥的抗逆性進行遺傳改良。

另外，遺傳密碼子有64種，但絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分，表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。利用偏愛密碼子避免利用率低的或稀有的密碼子稱為密碼子優(yōu)化。為了提高目的基因ThIPK2的表達量，本研究根據(jù)小麥的偏愛性密碼子對該基因進行了密碼子優(yōu)化。

有效的篩選標記基因?qū)τ谵D(zhuǎn)基因植物的獲得至關(guān)重要，目前常用的標記基因如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（neomycin phosphotransferaseⅡ）NPTⅡ基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hygromycin phosphotransferase）HPT基因等抗生素抗性基因及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricin acetyltransferase）Bar基因、乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase）ALS基因等。但這些標記基因滯留在植物體內(nèi)并持久表達不僅會給植物生長帶來負擔，而且還會給其他有利性狀基因的表達帶來一定的影響，因此它們的使用也引發(fā)了人們對轉(zhuǎn)基因安全性的隱憂[3～6]。為了解決這些弊端，獲取無選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物，應(yīng)運而生了玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，該系統(tǒng)作為無選擇標記基因的載體，利用了Ds元件能從染色體的一個位點轉(zhuǎn)移到另一個位點的特性，再通過后代重組自交與原初位點上的標記基因及Ac元件分離，進而得到只含有Ds元件的轉(zhuǎn)基因植株。該系統(tǒng)已經(jīng)被應(yīng)用于多種異源植物如轉(zhuǎn)基因番茄[7]、煙草[8]、水稻[9]、油菜[10]中并取得成功。

本研究利用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了一個含有密碼子優(yōu)化后的ThIPK2基因、強啟動子Ubiquitin及Ac/Ds轉(zhuǎn)座子的植物表達載體。該載體可進一步用于小麥的遺傳轉(zhuǎn)化，以期獲得高抗逆性及無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因小麥植株。

1材料與方法

11材料

111質(zhì)粒和菌株載體pBluescript SK、pBIOS1487、pBIOS645和pBIOS1717由本實驗室保存。大腸桿菌DH5α購自全式金公司。

112藥品及試劑高保真酶 Fast-pfu購自全式金公司；限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅴ、SalⅠ、SmaⅠ和NcoⅠ購自Fermentas公司；SalⅠ和PmeⅠ購自NEB（New England Biolabs）公司；DNA片段回收試劑盒購自Axygen公司；T4連接酶購自NEB公司；測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

12載體的構(gòu)建

121ThIPK2基因的密碼子優(yōu)化從NCBI網(wǎng)站上獲得ThIPK2基因序列和蛋白序列，根據(jù)野生型ThIPK2基因及蛋白的序列，參考小麥偏愛的密碼子，將重復(fù)的和不必要的酶切位點去掉，并兼顧優(yōu)化后低水平的GC含量，對ThIPK2基因進行密碼子優(yōu)化。

122載體PSAA001的構(gòu)建合成優(yōu)化好的ThIPK2基因序列（synZPK2）并連接到載體pBluescript SK，然后通過測序的方式鑒定目的序列的插入方向，完成載體PSAA001的構(gòu)建。這一步由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，流程圖中未列出。

123載體PSAA002的構(gòu)建用SalⅠ和NcoⅠ雙酶切載體PSAA001和pBIOS1487，將目的片段Ubiquitin啟動子連接到PSAA001 ThIPK2基因的上游，轉(zhuǎn)化Ecoli，對重組質(zhì)粒進行酶切檢測。

124載體PSAA003的構(gòu)建SalⅠ和SmaⅠ雙酶切載體PSAA002，用SalⅠ和EcoRⅤ雙酶切載體pBIOS645，將目的片段AtSac66終止子連接到PSAA002 ThIPK2基因的下游，轉(zhuǎn)化Ecoli，對重組質(zhì)粒進行酶切檢測。因為SmaⅠ和EcoRⅤ這兩種酶都是平末端限制性內(nèi)切酶，酶切后產(chǎn)生的都是平末端，可以用T4連接酶進行連接。

125載體PSAA004的構(gòu)建用SalⅠ和PmeⅠ雙酶切載體PSAA003和pBIOS1717，將上下游分別連接有啟動子和終止子的ThIPK2基因序列連接到植物表達載體骨架上，轉(zhuǎn)化Ecoli，對重組質(zhì)粒進行酶切檢測。