洋蔥ANS基因啟動子的克隆與瞬時表達分析

摘要：通過PCR方法對洋蔥花青素合成酶基因（AcANS）上游啟動子序列進行擴增，獲得長度為18 kb和22 kb的兩種片段，命名為ANSPM1和ANSPM2。序列分析表明，克隆到的兩個啟動子除含有多個TATA-box、CAAT-box等基本啟動子元件，還含有與MYB轉錄因子結合的元件，以及參與光響應、逆境、激素應答的順式作用元件。同時構建ANSPM1和ANSPM2驅動GUS報告基因的植物表達載體，通過洋蔥表皮細胞瞬時表達分析，表明兩個啟動子均有活性。

關鍵詞：洋蔥；花青素合成酶基因（ANS）；啟動子；克隆；瞬時表達

中圖分類號：Q785；Q786文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）05-0013-05

洋蔥（Allium cepa L）又稱球蔥、圓蔥、玉蔥、蔥頭，二年生草本植物，百合科蔥屬，是人們喜食的蔬菜。近些年人們更多地將洋蔥作為一種保健食品，因為洋蔥是富含類黃酮物質的蔬菜之一。

類黃酮是高等植物水溶性次生代謝產物，主要包括6類化合物：查爾酮、黃酮、黃烷雙醇、黃酮醇、花青素和原花色素[1]。已有研究指出，類黃酮具有抗氧化[2]、降低心血管疾病及癌癥風險的功能[3]。

花青素是一類重要的水溶性天然植物色素，屬于類黃酮物質，在植物體中廣泛分布。作為一種天然的食用色素，安全、無毒、資源豐富，而且具有重要的營養和藥理作用[4]。自然條件下游離的花青素極少見，常與一個或多個葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過糖苷鍵形成花色素苷。花青素合成酶（ANS）是位于花色素苷合成通路末端的酶，催化無色花色素向花色素的轉化[5]。自1990年Messen等利用轉座子標簽技術從玉米中分離了ANS基因后，學者們又先后在美國金鐘連翹（Forsythia×intermedia ）[6]、紫蘇（Perilla frutescens）[7]、蕪菁（Brassica campestris L ssprapa）[8]、紫菜薹（Brassica campestris var purpuraria）[9]、紫苤藍（Brassica oleracea varcaulorapa）[10]等植物中克隆了ANS基因，本課題組對AcANS基因進行了克隆和序列分析[11]，本研究即在此基礎上展開。

高等植物基因的表達調控是分子生物學研究領域的熱點，啟動子是基因表達調控的重要組成部分。深入研究啟動子的結構和功能，可利用基因工程技術對植物轉基因表達進行調控。為探索洋蔥ANS基因在轉錄水平上的表達調控機制，本實驗克隆了洋蔥ANS基因啟動子并對其調控元件、結構及功能進行分析。

1材料與方法

11植物材料與菌種

洋蔥材料、野生型擬南芥種子由本實驗室提供。洋蔥鱗莖采自山東省農業科學院蔬菜研究所試驗基地，取樣后迅速用液氮速凍后于-80℃保存，用于洋蔥基因組DNA的提取。

大腸桿菌（Ecoli）菌株TOP10購自天根生化科技（北京）有限公司。根癌農桿菌LBA4404菌株及植物雙元表達載體pBI121由本實驗室提供。

12試驗試劑

Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶HindⅢ、BamHⅠ、DNA Marker DL2000均購自TaKaRa公司。其余試劑均為進口或國產分析純。引物由博尚生物技術有限公司合成，見表1。測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。