擬南芥轉化體篩選中Basta噴灑時期和濃度試驗

摘要：為了更加方便有效地利用Basta來篩選帶草銨磷（PPT）抗性Bar基因的轉基因擬南芥，對不同時期噴灑不同濃度Basta的效果進行了研究。結果表明：擬南芥轉化體剛長出2片真葉時對Basta比較敏感，此時開始噴施效果比較好；PPT含量為135%的情況下，稀釋2 000～4 000倍噴施效果好，此時既可有效篩選出陽性苗，又不會抑制陽性苗的生長；第一次噴施后6天左右移栽陽性苗較好，此時可以明顯區分出陽性苗，且移栽后緩苗快、長勢好。

關鍵詞：擬南芥；噴灑；篩選；Basta；草銨膦（草丁膦，PPT）

中圖分類號：S482.4+9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）05-0096-04

擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為一種模式植物，具有基因組小、生長周期短、形體小、繁殖系數高、易于培養等優點[1]，而且基因組測序已經完成[2]。同時，擬南芥屬十字花科，具有高等植物的一般特點，擬南芥研究中所取得的成果很容易用于其它高等植物包括農作物的研究，可產生重大的經濟效益，因此擬南芥的研究越來越多地受到國際植物學界及各國政府的重視[3]。由于擬南芥轉基因操作簡便，技術成熟，并且具有各種功能缺失突變體，所以常被用來做基因功能研究。

在沒有克隆抗除草劑基因以前，人們一直采用一些對抗生素具有抗性的基因作為報告基因，如cat、hyg、npt Ⅱ等[4]。但是抗生素的成本較高，并且會由于轉化細胞對抗生素的解毒作用導致交叉保護，假陽性率高[5]。而抗除草劑基因作為報告基因，其篩選作用明顯， 檢測方法靈敏， 越來越受到人們的青睞，Bar基因是其中的代表[6]。

草銨膦（又名草丁膦）屬有機磷類除草劑， 是非選擇性廣譜除草劑Basta的活性成分，在一些文獻中常被稱為膦絲菌素（Phosphinothricin，PPT），它通過植物的葉片或其它綠色部分被快速吸收[7]。草銨膦強烈抑制植物中谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase， GS）活性，從而導致植物體內氮代謝紊亂，銨過量積累，葉綠體解體，進而光合作用受抑制，最終導致植物死亡[8]。

草銨膦抗性Bar基因編碼膦絲菌素乙酰轉移酶（Phosphinthricin acetyltransferase，PAT）， PAT使PPT的自由氨基乙酰化，使之不能抑制GS的活性，含有該基因的植物具有對Basta的抗性[9]。目前在轉基因擬南芥中Bar基因表達的檢測方法主要有：（1）在含有PPT的選擇培養基上觀察種子的萌發能力[10]，該方法種子消毒及播種都需要進行無菌操作，過程比較繁瑣，并且所需的純品PPT價格昂貴；（2）用PPT溶液進行全株噴灑，觀察植株的生存能力[11，12]，該方法不需無菌操作，操作簡便，使用市售的農用Basta即可，成本較低。但迄今為止，尚未見有關全株噴灑方法的專門報道。本試驗對不同時期和不同濃度Basta噴灑擬南芥的效果進行了研究，為篩選Bar基因為報告基因的轉基因植株提供了一定試驗參考。