水稻丙二烯氧化物合成酶基因OsAOS1的表達研究

摘要：茉莉酸（Jasmonate， JA）為植物病蟲害抗性反應中重要的信號分子，茉莉酸類物質生物合成途徑中的關鍵酶為丙二烯氧化物合成酶（Allene oxide synthase， AOS）。已知水稻AOS基因家族包括4個成員，OsAOS1～OsAOS4。已有研究表明，水稻OsAOS2基因的過量表達提高了內源PR1基因的表達、增強了水稻對稻瘟病的抗性。本研究分析了OsAOS1基因表達的組織和器官特異性以及外源JA處理對OsAOS1基因表達的影響，同時利用轉基因技術研究了OsAOS1基因在調控內源PR1基因表達中的作用。研究結果表明：OsAOS1基因表達的組織和器官特異性不同于OsAOS2基因；外源JA處理誘導OsAOS1基因的瞬時表達，然而OsAOS2基因的誘導表達延遲； OsAOS1過量表達抑制煙草中內源PR1基因的表達。據此推測OsAOS1基因可能不參與依賴于PR1的抗病反應。

關鍵詞：水稻； 茉莉酸； 丙二烯氧化物合成酶； 轉基因； PR1基因

中圖分類號：Q786文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）05-0001-05

最早從真菌Lasiodiplodia theobromae培養液中分離得到茉莉酸（Jasmonate， JA）[1]，后來的研究表明JA在植物的生長發育以及抗性方面均具有重要作用，例如JA在種子的萌發、根的生長、植物的育性和衰老等重要的生理過程中起作用[2～7]。近幾年來，越來越多的研究表明JA作為一種防衛信號分子起作用，參與雙子葉植物病蟲害抗性反應[8～11]。

雖然JA在單子葉植物抗性反應中的功能遠不如雙子葉植物中了解的清楚，但是仍有一些證據間接表明了JA在水稻抗病反應中具有重要作用。外源JA處理能夠誘導水稻PR1基因（PR1a和PR1b）的表達[12～14]。JA生物合成抑制劑處理水稻能夠降低內源JA的含量，同時也降低了病原菌誘導的PR1蛋白的積累水平[15]。

JA的生物合成途徑也稱類十八烷生物合成途徑：亞麻酸經脂氧合酶（Lipoxygenase， LOX）催化合成13（S）-氫過氧化亞麻酸（13-hydroperoxylinolenic， 13-HPOT），13-HPOT在丙二烯氧化物合成酶（Allene Oxide Synthase， AOS）、丙二烯氧化物環化酶（Allene Oxide Cyclase， AOC）等酶類的催化下生成10，11-二氫-12-氧植物二烯酸（12-oxo-phytodienoic acid， OPDA）[16]。OPDA再經過三次β氧化后生成JA[17]，另外，JA還可以被廣泛地修飾。

可見，AOS是JA生物合成途徑中的一個關鍵酶。亞麻（Linum usitatissimum）AOS基因在馬鈴薯中過量表達可提高轉基因植株中JA含量[18]；而擬南芥AOS基因的過量表達卻不能提高轉基因擬南芥和煙草中JA水平，除非受到機械損傷誘導[19]。水稻基因組中含有4個AOS基因[20，21]。其中，OsAOS1基因編碼的產物具有葉綠體轉運肽，其表達受傷處理快速瞬時誘導，這種結構特征以及表達特征都與雙子葉植物AOS基因相似，而不同于單子葉植物中AOS基因。Mei等（2006）[24]的報道表明，水稻OsAOS2基因過量表達能夠提高水稻內源JA含量、誘導PR基因表達以及增強對稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的抗性[22]。為了研究OsAOS1在水稻生長發育中的作用，我們分析了OsAOS1基因表達的器官特異性、對外源JA處理應答反應。此外，我們還構建了OsAOS1基因的過量表達載體并轉化煙草，為進一步研究OsAOS1基因的功能奠定基礎。

1材料與方法

11植物材料

試驗中所用的水稻材料為日本晴品種（Oryza sativa L cv Nipponbare），所用煙草材料為SR品種（Nicotiana tabacum cv Petit Havana SR）。

12植物材料的培育

日本晴水稻種子表面消毒后，播種于04%（W/V）的瓊脂培養基中，在光照培養箱（寧波江南）中培養7天，然后移栽至溫室土壤中（白天，28℃/夜晚，23℃）繼續培養至六葉一心期。

13OsAOS基因表達的器官特異性分析

日本晴水稻在溫室中長至六葉一心期時，從土壤中拔出，把根部清洗干凈。分別取根部（10個植株）、莖部（20個植株）、葉片（3個植株），液氮中速凍，然后置于-70℃低溫冰箱中保存，用于2個AOS基因的表達分析。莖部取材時盡量去除葉子；葉片為第六葉。

14外源JA處理

茉莉酸（購于Sigma公司）溶于甲醇，配成100 mmol/L的儲存液，使用時用滅菌蒸餾水稀釋為100 μmol/L的工作液。Mock處理使用1‰的甲醇水溶液。分別利用上述溶液噴灑六葉一心期野生型水稻，直至葉片有水珠滴落為止，分別在0、2、6、24和48 h時取第六片葉，在液氮中速凍，然后置于-70℃低溫冰箱中保存，用于AOS基因表達水平分析。每個時間點取3個植株葉片混合物作為樣品。

15OsAOS1基因表達載體的構建

根據OsAOS1（AK068620）基因的核苷酸序列設計PCR引物對：fFw：5′TAGGTCTAGATCATCGGATCAAGGG3′/fRv：5′GACTCGAGGGCGCCGGAGACTTTG3′（其中下劃線序列分別是Xba Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內切酶的識別序列），利用TaKaRa高保真酶（PrimerSTAT HS DNA Polymerase）從水稻基因組中擴增OsAOS1基因，克隆到pMD18-T載體（TaKaRa），篩選陽性克隆，并通過測序確認核苷酸序列的正確性。通過Xba Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切將OsAOS1基因克隆到雙元表達載體pPZP2Ha3 （+）的35S啟動子（P35S）和Tnos之間，構建35S∶OsAOS1表達載體。

16煙草轉化

將上述OsAOS1基因表達載體通過熱激法轉化農桿菌EHA105[22]。采用葉盤法[23]轉化煙草。

17OsAOS1基因和PR1基因在轉基因植株中的表達情況

在轉基因煙草種子成熟階段取上部幼嫩葉片，液氮凍存。用于分析OsAOS1、NtPR1a和NtPRB1b的表達情況。

18RNA分析

RNA的提取按照TaKaRa RNAisoTM plus（TaKaRa）說明書進行操作，利用RNase-free DNase Ⅰ（TaKaRa）除去RNA中的DNA，按EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書（全式金）進行逆轉錄反應。本研究中所用引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成，所擴增基因在GenBank/EMBL 數據庫中的序列號和PCR擴增條件如表1所示。利用20%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。利用Gel-Pro Analyzer 40 software （Media Cybernetics， USA）分析PCR條帶的信號強度，并計算目的基因與內標基因（OsActin、OsUBQ和NtActin基因）的相對值。

2結果與分析

21OsAOS1和OsAOS2基因在水稻不同器官中的表達

通過比較2個水稻AOS基因在根、莖和葉片中的表達水平，可以看出OsAOS1和OsAOS2基因表達的器官特異性相似，但這兩個基因相對表達量差距較大。OsAOS1和OsAOS2基因在根、莖和葉片中的表達都依次降低，OsAOS1基因在這些器官中的相對表達量差異比較小，而OsAOS2基因在這些器官中的相對表達量差異較大（圖1）。據此推測，OsAOS1基因在水稻生長發育中的作用可能不同于OsAOS2基因。

A：利用RT-PCR分析OsAOS1和OsAOS2基因在水稻根、莖和葉子中的轉錄本水平；B：OsAOS1和OsAOS2基因相對OsActin的表達分析

圖1OsAOS基因在六葉期水稻植株不同器官中的表達

22外源JA對OsAOS1基因和OsAOS2基因表達的影響

外源JA處理2 h，葉片中OsAOS1基因的表達被明顯誘導，隨后OsAOS1基因的表達逐漸降低。而OsAOS2基因的誘導表達出現在JA處理后24 h，然后持續表達（圖2）。這個結果表明，OsAOS1和OsAOS2基因都參與了JA依賴的反應，但是反應機制不同。值得注意的是Mock處理對OsAOS2的表達有一定的影響，這可能是由于噴灑甲醇溶液時，氣流對葉子產生一種機械作用所導致，而OsAOS1基因可能不參與該途徑。

A：利用RT-PCR分析外源JA處理后不同時間點OsAOS1和OsAOS2基因的表達水平；B：OsAOS1基因和OsAOS2基因相對OsUBQ的表達分析

圖2外源JA處理對水稻葉片OsAOS1基因和

OsAOS2基因表達水平的影響

23OsAOS1轉基因煙草抑制NtPR1基因的基礎表達

已有研究表明，煙草的NtPR1a和NtPRB1b與煙草的抗病性直接相關[25，26]。因此，我們構建了OsAOS1基因的過量表達載體（圖3A），轉化至煙草中，分析了T2代轉基因煙草中OsAOS1基因的表達水平與NtPR1a基因和NtPRB1b基因的表達水平之間的關系。如圖3B和3C所示，轉基因煙草不同株系中OsAOS1基因的表達水平均高于非轉基因煙草。與此相反，NtPR1a和NtPRB1b的表達水平明顯低于非轉基因煙草植株。這些結果表明OsAOS1基因在煙草中的過量表達抑制了煙草PR1基因的表達。

注：15-2、19-2、20-3和22-1是4個不同的轉基因煙草株系， SR是野生型煙草。

A：轉OsAOS1基因表達載體示意圖；B：利用RT-PCR分析OsAOS1轉基因煙草中OsAOS1和NtPR1基因的表達情況；C：OsAOS1和NtPR1基因相對于NtActin的表達分析

圖3轉基因煙草中OsAOS1的過量表達抑制NtPR1基因的表達水平

3討論

本研究發現，OsAOS1和OsAOS2基因表達的器官特異性和對外源JA處理的應答反應均不同。此外，有報道表明傷處理誘導OsAOS1基因快速瞬時表達[21]，而OsAOS2基因不受傷處理的誘導[24]。Haga和Iino（2004）構建的AOS蛋白系統進化樹顯示OsAOS1在進化樹上的位置相對其他單子葉AOS蛋白更接近于雙子葉植物AOS[21]。這些表達和結構上的不同可能決定了OsAOS1和OsAOS2功能上的差異。

OsAOS2基因過量表達激活了JA應答的OsPR1a和OsPR1b的表達[22]。然而在OsAOS1基因過量表達的轉基因煙草，內源PR1基因的表達均被抑制。通過對轉基因煙草中PR1基因的表達情況分析，我們推斷OsAOS1基因可能是負調控JA應答反應中PR1基因的表達。我們做了如下假設：在轉基因煙草中，外源AOS基因和內源AOS基因的底物相同，當OsAOS1基因過表達后，通過該條途徑的JA反應會明顯增強，OsAOS1調控的JA反應可能不直接影響PR1基因的表達。但是如此一來，因為底物的限制，通過煙草內源的、與PR1基因表達相關的AOS基因所調控的JA反應就會減弱，導致煙草內源PR1基因的表達降低。我們需要更多直接證據來驗證這個假設。

此外，外源JA、SA和稻瘟病能夠誘導水稻PR1a和PR1b基因的表達，所以 PR1a和PR1b基因被認為與水稻抗病反應相關[27，28]。OsAOS1基因的過量表達抑制了NtPR1a和NtPRB1b基因的表達，因此OsAOS1基因可能不參與水稻抗病反應。Haga 和 Iino （2004）的研究表明，OsAOS1基因參與調控光敏色素介導的水稻胚芽鞘延伸，因為在OsAOS1基因缺失的突變體cpm1中，光敏色素介導的胚芽鞘生長抑制現象明顯小于野生型[21]。OsAOS1基因在水稻生長發育中的其它作用，還需要我們進一步分析AOS1轉基因水稻和煙草植株的生理、生化特征及對各種生物脅迫和非生物脅迫的反應。

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