雌二醇對內毒素誘導的骨髓巨噬細胞白介素—10的表達影響及機制研究

[摘要] 目的 研究雌二醇對內毒素誘導的小鼠骨髓巨噬細胞白介素-10（IL-10）的表達調控作用及其相關機制，以期為臨床更好地防治相關炎性疾病提供新思路。方法 選用4周齡C57BL/6j雄性小鼠，體外培養骨髓巨噬細胞。收集細胞，用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測雌激素受體。將細胞與內毒素孵育的同時，分別加入雌二醇，他莫昔芬及雌二醇，24h后收集培養液，用ELISA法檢測IL-10的含量，并提取細胞蛋白，用Western blotting法檢測各處理組核轉錄因子κB（NF-κB）的激活情況。 結果 激光共聚焦掃描顯微鏡檢測結果顯示小鼠骨髓巨噬細胞表達雌激素受體。ELISA檢測結果顯示內毒素誘導細胞表達IL-10，雌二醇本身對IL-10的表達無影響，卻可抑制內毒素誘導的IL-10表達，而此抑制作用被他莫昔芬拮抗。同時，Western blotting檢測到內毒素激活細胞NF-κB通路，雌二醇抑制內毒素誘導的NF-κB活化，而此抑制作用可被他莫昔芬拮抗。結論 雌二醇通過雌激素受體抑制內毒素誘導的小鼠骨髓巨噬細胞IL-10的表達，此抑制作用與雌激素抑制內毒素對細胞NF-κB通路的激活有關。

[關鍵詞] 雌激素；巨噬細胞；白介素-10；核轉錄因子-κB

[中圖分類號] R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）19-24-03

雌激素是機體重要的激素之一，不僅在雌性個體的發生、生長發育和生殖等方面起著至關重要的作用，還具有多種生物效應，大量臨床及流行病學資料顯示，雌激素可調控炎癥反應，其作用機制復雜多樣，影響某些涉及炎性病理過程的疾病的發生發展及轉歸[1]。目前，性激素影響機體炎癥反應的研究熱點集中在性激素對炎性細胞的調節上[2]。本

實驗在體外分離培養小鼠骨髓巨噬細胞，用內毒素激活巨噬細胞表達，研究雌二醇對巨噬細胞抗炎介質白介素-10（interleukin-10，IL-10）的表達調控作用及相關機制，以期為臨床更好地防治相關炎性疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

4周齡雄性C57BL/6j小鼠，購自中國科學院上海實驗動物中心。RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；小鼠巨噬細胞集落刺激因子，IL-10 ELISA試劑盒購自美國RD公司；雌激素受體α抗體，雌激素受體β抗體，NF-κB （65kDa）抗體， 聚合酶PARP抗體，辣根過氧化物酶-二抗，異硫氰酸熒光素-二抗購自美國Santa Cruz公司。內毒素，雌二醇，他莫昔芬購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 BMM的制備 選用4周齡雄性C57BL/6j小鼠[實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2007-0035]，頸椎脫臼處死。無菌條件下取雙側股骨，剪去骨兩端，用RPMI 1640培養液沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞，分散后培養于含巨噬細胞集落刺激因子（10ng/mL）及10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中。1d后，去除貼壁細胞，收集未貼壁細胞，調整細胞濃度至5×106個/mL，置于含巨噬細胞集落刺激因子（10ng/mL）的RPMI 1640完全培養液中繼續培養，5d后收集貼壁細胞備用。

1.2.2 激光共聚焦掃描顯微鏡檢測雌激素受體的表達 取200μL細胞懸液，滴加于多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，0.5%多聚甲醛固定30min，避光分別于與雌激素受體α、β抗體孵育30min，磷酸鹽緩沖液漂洗玻片，異硫氰酸熒光素-二抗孵育30min，磷酸鹽緩沖液漂洗玻片，孵育完畢，用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測熒光分布狀況。

1.2.3 ELISA檢測細胞因子白介素-10的表達 實驗按不同處理因素分為空白對照組、內毒素組（1μg/mL）、雌二醇組（1nM）、雌二醇+內毒素組、他莫昔芬（10nM）+雌二醇+內毒素組，24h后吸取培養上清用于細胞因子IL-10的測定。采用ELISA抗體夾心法，每組設3個復孔，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4 Western blotting分析NF-κB的活化 實驗分組同上，處理因素作用24h后，提取細胞核蛋白用Western blotting法檢測NF-κB的活化。按每孔50μg 蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉移至PVDF膜上（Millipore， MA，USA），將膜用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液（10mM Tris，150mM NaCl，and 0.05% Tween 20）在室溫下封閉1h后，與特異性一抗（用TBST緩沖液按1︰2000稀釋）室溫下孵育2h，再與辣根過氧化物酶-二抗室溫孵育1h，然后將膜經化學發光法檢測，暗室曝光，膠片沖洗晾干后掃描蛋白條帶。

1.3 統計學處理

數據采用SPSS10.0軟件統計學分析，數值以（）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雌激素受體的檢測結果

多數骨髓巨噬細胞細胞呈梭形或星形，部分為圓形。將巨噬細胞分別與雌激素受體α、β抗體及異硫氰酸熒光素-二抗孵育后，用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測其與巨噬細胞的結合狀況。結果顯示，熒光物質分布于細胞胞漿中，骨髓巨噬細胞表達雌激素α受體及β受體。見圖1。

2.2 細胞因子IL-10的表達情況

ELISA檢測結果顯示，與對照組相比（152±18）pg/mL，內毒素誘導細胞表達IL-10（956±72）pg/mL，雌二醇本身對細胞IL-10的表達無影響（166±21）pg/mL，卻可抑制內毒素誘導的IL-10表達（623±40）pg/mL，而此抑制作用被他莫昔芬拮抗（998±56）pg/mL。見圖2。

2.3 NF-κB的活化情況

Western blotting檢測結果顯示，在內毒素的作用下，骨髓巨噬細胞內NF-κB活化，核內NF-κB p65含量顯著增加，雌二醇本身對細胞NF-κB的活化無影響，卻可下調內毒素誘導的NF-κB p65的增加，說明雌二醇可以抑制內毒素誘導的骨髓巨噬細胞NF-κB信號途徑的激活，而此抑制作用可被他莫昔芬拮抗。見圖3。

3 討論

雌激素主要包括雌酮、雌二醇和雌三醇，其中以雌二醇的生理功能最強。雌激素是女性生殖系統生長發育所必需的類固醇激素，但必須指出的是， 雌激素也顯示出潛在的促炎作用，一些研究發現， 選擇性抑制雌激素β受體能夠抑制促炎癥反應基因的轉錄， 雌激素β受體選擇性抑制劑顯示具有抗炎作用[3]。目前，性激素影響機體炎癥反應的研究熱點集中在性激素對炎性細胞的調節上[2]。炎癥啟動的特征是炎性細胞的激活，巨噬細胞作為一種重要的炎性細胞，靜止期時殺傷感染細胞的活性較弱，經內毒素等因子激活后，其表面受體的表達增強，可以將效應物質釋放到胞外，介導炎癥反應[4-5]。

本研究發現，內毒素誘導骨髓巨噬細胞表達抗炎介質IL-10，雌二醇本身對細胞IL-10的表達無影響，卻可抑制內毒素誘導的IL-10表達。IL-10 屬于細胞因子中的干擾素家族，目前發現IL-10能通過下調單核細胞表面主要組織相容性抗原Ⅱ的表達， 降低其抗原呈遞作用，調T 淋巴細胞活性，抑制炎性細胞的激活、遷移和粘附；同時，IL-10 也能抑制炎癥因子的合成與釋放。Rene等發現，內源性與外源性IL-10 均能在轉錄水平強烈抑制IL-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α、粒-巨噬細胞集落刺激因子和粒細胞集落刺激因的合成， 從而起到抗炎的作用。

傳統理論認為類固醇激素對靶細胞的作用是由其細胞內受體介導的，該受體屬于配體依賴的轉錄因子超家族，在結構上有很大的保守性，激素通過自由擴散進入胞漿并與相應受體結合，活化的受體二聚體與激素反應元件特異結合，啟動下游相關基因轉錄，繼而合成相應的蛋白質[6-7]。我們用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測到，骨髓巨噬細胞內存在雌激素α受體、β受體，而雌二醇抑制內毒素誘導的小鼠骨髓巨噬細胞IL-10的表達可被雌激素受體阻斷劑他莫昔芬拮抗，因此，雌二醇的抑制作用是通過雌激素受體介導的。

NF-κB通路是內毒素誘導炎癥因子表達的關鍵信號通路[8-9]。NF-κB在正常情況下以p65 /p50異源二聚體的形式存在于胞漿中，在各種因素刺激下，NF-κB迅速激活，p65亞基進入核內直接作用于轉錄元件而激活轉錄過程，調節多個炎癥反應相關基因的轉錄。我們發現，內毒素可以激活骨髓巨噬細胞的NF-κB信號分子，細胞核內NF-κB p65蛋白增多，而雌二醇可以減少巨噬細胞NF-κB p65入核，降低了NF-κB的活性。而此抑制作用可被雌激素受體阻斷劑他莫昔芬拮抗，說明雌二醇對NF-κB通路的抑制作用是雌激素受體介導的。

雌激素具有確切的促炎作用，本研究實驗結果也表明，雌二醇可以增強內毒素引起的炎癥反應，雌二醇通過雌激素受體抑制內毒素誘導的骨髓巨噬細胞抗炎介質IL-10的表達，其機制與雌激素抑制NF-κB途徑的信號轉導途徑激活有關。但必須指出的是，雌激素也可限制炎癥反應，影響某些涉及炎性病理過程疾病的發生發展及轉歸。例如，雌激素限制中性粒細胞黏附分子及促炎介質表達，可減輕受損冠脈局部炎癥反應[10]；雌激素能影響單核細胞分化為成熟巨噬細胞，在炎癥階段下調蛋白激酶和細胞因子的表達，造成愈合障礙[11]；此外，雌激素對于肺部感染性疾患及創傷性休克具有保護作用[12-13]；臨床上，更年期婦女因雌激素水平下降容易出現多種炎癥的發生。

由于雌激素受體的分布以及信號調控方式復雜，進一步深入研究闡明雌激素對炎癥過程的精確調節模式，對于避免雌激素引發的不良反應以及增加雌激素的治療效果具有重要意義。并且，對IL-10 抗炎機制的了解， 也會為我們防治病原體感染， 探索更多自身炎癥性疾病的新的治療策略開辟更為廣闊的空間。

[參考文獻]

[1] Straub RH. The complex role of estrogens in inflammation [J]. Endocr Rev，2007，28（5）：521-574.

[2] Calippe B，Douin-Echinard V，Delpy L，et al.17Beta-estradiol promotes TLR4-triggered proinflammatory mediator production through direct estrogen receptor alpha signaling in macrophages in vivo [J].J Immunol，2010，185（2）： 1169-1176.

[3] Cvoro A，Tatomer D，Tee MK，et al.Selective estrogen receptor-beta agonists repress transcription of proinflammatory genes [J].J Immunol，2008，180（1）：630-636.

[4] Naito M.Macrophage differentiation and function in health and disease[J]. Pathol Int，2008，58（3）：143-155.

[5] Nagamatsu T，Schust DJ.The immunomodulatory roles of macrophages at the maternal-fetal interface[J].Reprod Sci，2010，17（3）：209-218.

[6] Stossi F，Barnett DH，Frasor J，et al.Transcriptional profiling of estrogen-regulated gene expression via estrogen receptor （ER） alpha or ER beta in human osteosarcoma cells：distinct and common target genes for these receptors [J].Endocrinology，2004，145（7）：3473-3486.

[7] Favre J，Gao J，Henry JP，et al.Endothelial estrogen receptor α plays an essential role in the coronary and myocardial protective effects of estradiol in ischemia/reperfusion[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（12）：2562-2567.

[8] Edwards MR，Bartlett NW，Clarke D，et al.Targeting the NF-kappaB pathway in asthma and chronic obstructive pulmonary disease [J]. Pharmacol Ther，2009，121（1）：1-13.

[9] Wong ET，Tergaonkar V.Roles of NF-kappaB in health and disease： mechanisms and therapeutic potential[J]. Clin Sci，2009，116（6）：451-465.

[10] Miller AP，Feng W，Xing D，et al.Estrogen modulates inflammatory mediator expression and neutrophil chemotaxis in injured arteries[J].Circulation， 2004， 110（12）：1664-1669.

[11] Ashcroft GS， Mills SJ， Lei K， et al. Estrogen modulates cutaneous wound healing by downregulating macrophage migration inhibitory factor[J].J Clin Invest，2003，111（9）：1309-1318.

[12] Doucet DR，Bonitz RP，Feinman R，et al. Estrogenic hormone modulation abrogates changes in red blood cell deformability and neutrophil activation in trauma hemorrhagic shock [J].J Trauma，2010，68（1）：35-41.

[13] Vegeto E，Cuzzocrea S，Crisafulli C，et al.Estrogen receptor-alpha as a drug target candidate for preventing lung inflammation [J]. Endocrinology，2010，151（1）：174-184.

（收稿日期：2013-07-24）

[基金項目] 國家自然科學基金資助項目（31000630）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK2010217）。