HPA、CK2β與HIF—1α在鼻咽癌組織中協(xié)同作用的研究

[摘要] 目的 檢測(cè)乙酰肝素酶（HPA）、蛋白激酶CK2β（CK2β）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在NPC組織中的表達(dá)的相關(guān)性，分析它們的相互關(guān)系。 方法 采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)Super-Vision法檢測(cè)49例鼻咽癌（NPC）組織標(biāo)本中HPA、CK2β及HIF-1α的表達(dá)水平。 結(jié)果 HPA、CK2β與HIF-1α任意兩者間在NPC組織中的表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。 結(jié)論 在NPC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，HPA、CK2β和HIF-1α之間存在協(xié)同作用，三者之間可能產(chǎn)生一種“連鎖效應(yīng)”促進(jìn)了NPC的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 鼻咽腫瘤；乙酰肝素酶；蛋白激酶CK2β；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

[中圖分類號(hào)] R739.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）19-27-03

乙酰肝素酶（heparanase，HPA）、蛋白激酶CK2β（protein kinase CK2β，CK2β）和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-lα）分別與頭頸部腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后之間密切相關(guān)[1-3]，但它們之間在頭頸部腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是否存在著協(xié)同作用以及它們之間相互作用的可能機(jī)制尚不明確，而且三者與鼻咽癌（NPC）關(guān)系的研究報(bào)道極少，本文研究三者在NPC發(fā)生發(fā)展中的協(xié)同作用及相互之間可能的作用機(jī)制，以深入探討它們的生物學(xué)行為。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2003年在我院放療科收治未接受任何治療的49例原發(fā)性NPC病例，均為低分化鱗癌；其中男39例，女10例；發(fā)病年齡<50歲26例，≥50歲23例。采用國(guó)內(nèi)鼻咽癌2008分期方案標(biāo)準(zhǔn)：T1期5例，T2期22例，T3期14例，T4期8例；治療前頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：N0期13例，N1期7例，N2期21例，N3期8例；TNM分期：Ⅰ期1例，II期7例，III期26例，Ⅳ期15例；治療后無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移24例、有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移25例。取15例病理確診為慢性鼻咽炎（CNT）的石蠟組織標(biāo)本作對(duì)照。

1.2 主要試劑

兔抗人蛋白激酶（Casein KinaseⅡ bate subunit，CK2β）單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Epitomics生物技術(shù)公司；兔抗人乙酰肝素酶（Heparanase，HPA）多克隆抗體、兔抗人缺氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）多克隆抗體、Super Vision兩步法免疫試劑盒、DAB顯色試劑盒及抗原修復(fù)液Ⅰ（胰蛋白酶），購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)49例NPC組織標(biāo)本及15例CNT組織對(duì)照標(biāo)本采用Super Vision二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色法。

1.4 染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

HPA陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜，呈棕褐色顆粒狀著色；CK2β陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色，部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)也可見(jiàn)著色；HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色細(xì)顆粒狀著色。以細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞膜上出現(xiàn)黃色染色為陽(yáng)性標(biāo)記（圖1～3）。參照半定量評(píng)分方法[4]，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（200×）觀察：將陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4級(jí)并分別記為0、1、2、3分，陽(yáng)性細(xì)胞<25%為0分、25%～49%為1分、50%～74%為2分、≥75%為3分；無(wú)顯色為0分、淺黃色為1分、桔黃色為2分、棕黃色為3分。將兩項(xiàng)計(jì)分相加后除以2得出最后評(píng)分，將0分定為陰性（-），0.5分、1.0分為弱陽(yáng)性（+），1.5分、2.0分為陽(yáng)性（++），2.5分、3.0分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。將陰性與弱陽(yáng)性表達(dá)合并歸為低表達(dá)、陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)合并歸為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Spearman相關(guān)性分析三種基因表達(dá)水平之間在NPC組織中的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HPA、CK2β、HIF-1α三者在NPC組織中的表達(dá)通過(guò)Spearman相關(guān)分析，三種基因任意兩者之間的表達(dá)水平均有正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），見(jiàn)表1～3。

3 討論

HPA是一種能降解糖氨聚糖中硫酸乙酰肝素蛋白多糖上HS側(cè)鏈的D-葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，而糖氨聚糖正是構(gòu)成細(xì)胞防御腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移屏障的重要組成部分。HPA切斷HS側(cè)鏈后，能通過(guò)促進(jìn)DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤血管生成[5]等方面加快腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)生長(zhǎng)。本研究表明HPA在NPC中高表達(dá)可能通過(guò)破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜所構(gòu)成的防御屏障，促進(jìn)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

腫瘤發(fā)生、發(fā)展與蛋白激酶CK2對(duì)蛋白的磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮的重要作用密切相關(guān)。蛋白激酶CK2由CK2α和CK2β亞基組成，CK2α能磷酸化細(xì)胞的功能蛋白，影響癌基因及抗癌基因產(chǎn)物，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移[6-7]。而CK2β的主要功能是穩(wěn)定CK2α的結(jié)構(gòu)不受破壞，故CK2β可通過(guò)對(duì)CK2α的影響在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。本研究提示CK2β的表達(dá)可能通過(guò)對(duì)CK2α的影響在鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

HIF-1α是能夠與促紅細(xì)胞生成素（EPO）基因的缺氧應(yīng)答元素（hypoxia response element，HRE）特異性地結(jié)合的核轉(zhuǎn)錄因子，參與許多缺氧疾病的發(fā)展過(guò)程。HRE是對(duì)缺氧可做出應(yīng)激反應(yīng)的缺氧反應(yīng)基因（hypoxia response gene，HRG）內(nèi)一段小于100bp的單拷貝或多拷貝的順式作用元素。缺氧是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特性，在缺氧的條件下，HRE能夠與轉(zhuǎn)錄因子HIF-1結(jié)合，使得腫瘤細(xì)胞內(nèi)缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)發(fā)生變化，對(duì)缺氧作出應(yīng)激反應(yīng)[8-9]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物增加，參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展[10-11]。本研究提示HIF-1α的高表達(dá)在缺氧情況下NPC發(fā)生發(fā)展的速度可能更快。

三種基因在NPC中均為高表達(dá)，但三者之間有無(wú)聯(lián)系呢？研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在缺氧的條件下能快速增長(zhǎng)，缺氧狀態(tài)造就了組織酸性環(huán)境，而且HPA只在酸性環(huán)境中發(fā)揮作用。這提示我們是否存在缺氧因子參與了腫瘤細(xì)胞中HPA基因表達(dá)過(guò)程或參與了對(duì)HPA生物活性的調(diào)控。He等[12]研究發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境能增強(qiáng)卵巢癌HPA的生物活性，但對(duì)其蛋白及mRNA無(wú)論在數(shù)量上還是在體積上均沒(méi)有太大改變。馬建剛等[13]研究表明缺氧可顯著提高人喉癌 Hep-2細(xì)胞HPA蛋白的表達(dá)及其細(xì)胞的侵襲力，認(rèn)為其侵襲力的增加可能與HPA表達(dá)水平增高有密切關(guān)系，上述兩組學(xué)者的研究證實(shí)缺氧能上調(diào)腫瘤細(xì)胞中HPA的活性。劉嘉琳等[14]探討HPA和HIF-1α在食管鱗癌中的表達(dá)及其與食管鱗癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HPA和HIF-1α在腫瘤組織中的表達(dá)均高于切緣正常組織，HPA和HIF-1α表達(dá)與食管鱗癌組織浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且兩者在食管鱗癌組織中的表達(dá)關(guān)系密切。此外姚俊等[15]在膽管癌中，張磊等[16]在胃癌中均發(fā)現(xiàn)HPA和HIF-1α在腫瘤組織中共同高表達(dá)，與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Richard等[17]報(bào)道HIF-1α可通過(guò)ERK/ MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被直接磷酸化，但通過(guò)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路只能夠激活HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，并未能使HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性增加。以上實(shí)驗(yàn)證據(jù)有趣的說(shuō)明了在腫瘤組織中三者之間存在著某種相互關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)等級(jí)相關(guān)分析顯示任意兩者之間在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平均有正相關(guān)關(guān)系（P均<0.05），說(shuō)明三者之間在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在著協(xié)同作用，我們通過(guò)這三種基因各自的生物學(xué)特征，分析這種協(xié)同作用的可能機(jī)理是：CK2β通過(guò)穩(wěn)定CK2α而發(fā)揮作用，CK2α磷酸化作用增加HPA、HIF-1α基因的表達(dá)，HIF-1α的表達(dá)使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)和耐受缺氧狀態(tài)并形成酸性環(huán)境，而缺氧狀態(tài)下的酸性環(huán)境又進(jìn)一步使HPA的表達(dá)發(fā)生作用，從而共同促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，三者之間可能產(chǎn)生一種“連鎖效應(yīng)”促進(jìn)了NPC的發(fā)生發(fā)展。提示臨床上利用三種基因的多靶點(diǎn)重組抑制劑可對(duì)鼻咽癌的治療產(chǎn)生良好的效應(yīng)。

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（收稿日期：2013-08-26）