一種云南習用骨碎補對摘除卵巢所致大鼠骨質疏松的治療作用

作者簡介：鄭永仁（1965～），男，云南楚雄人，實驗師，主要從事實驗動物和動物實驗工作；

通信作者：楊和金（19725～），男，云南省牟定人，高級工程師，主要從事新藥開發，藥理研究，動物疾病模型研究以及物實驗動物管理等方面工作，郵箱：yanghejindayuan@siancom

摘要：目的：研究云南習用骨碎補老鷹翅膀對摘除卵巢所致大鼠骨質疏松的治療作用。方法：雌性SD大鼠，除正?？瞻捉M（假手術組）外、其余大鼠去卵巢造成大鼠骨質疏松模型，隨機分為模型組、陽性組（雌二醇組）及老鷹翅膀低、中、高劑量組，每組12只大鼠，觀察給予老鷹翅膀治療60 d后大鼠骨質量、骨密度、骨組織形態計量學及血漿中磷、鈣、堿性磷酸酶（ALP）及骨生物力學指標的變化。結果：與空白組比較，模型組的大鼠骨密度、骨質量均有不同程度的降低，血漿中ALP顯著升高，Ca含量降低，骨生物力學指標顯著降低，骨小梁數量減少，骨皮質厚度變薄，成骨細胞數顯著降低，破骨細胞數顯著升高，與模型組比較，陽性藥組及經老鷹翅膀治療60d后的三劑量組，摘除卵巢所致骨質疏松大鼠的骨密度、骨質量均有不同程度的升高，骨組織形態計量學參數變化均有顯著性差異，血漿中ALP顯著降低，Ca、P含量升高，骨生物力學各指標顯著升高，骨小梁數量增加，骨皮質厚度變厚，成骨細胞數顯著增加，破骨細胞數顯著降低。結論：老鷹翅膀對摘除卵巢造成的大鼠骨質疏松有一定的防治作用。

關鍵詞：骨質疏松；去卵巢大鼠；骨碎補；模型

中圖分類號：R2856

文獻標識碼：A

文章編號：1007-2349（2013）07-0057-03

骨質疏松（Osteoporosis OP）是一種全身代謝性骨骼疾病，主要特征表現為全身骨量減少和骨組織微細結構退化，引起骨脆性增加和骨密度降低，骨折危險性增加[1]。隨著中國人口老齡化問題日趨嚴重，老年性骨質疏松癥患者愈來愈多。

祖國的中醫藥在治療骨病有悠久歷史和有效地方法，中醫理論認為骨質疏松癥病機為腎虛精虧，髓虛脈痹，腎主骨，腎水既痼，則諸骨枯，導致腎虛腰脊疼痛、下肢痿弱、耳鳴耳聾等癥。骨質疏松癥病位在骨，其本在腎，從腎著手治療是根本大法之一。腎與骨的生理、病理有密切關系，即“腎主骨”的理論。骨碎補味苦、性溫，入肝、腎經。功用補腎活血、止血，始載于《雷公炮炙論》，主治腎虛腰痛，跌打閃挫，骨傷，風濕痹痛，臨床多用于各種骨病。按照中醫理論骨碎補可以治療各種原因導致的由于腎虛引起的骨質疏松。

正品骨碎補：為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）JSmith的干燥根莖，性溫，味苦，入肝、腎二經，具有補腎、活血、止血的功能?，F代研究表明：骨碎補根莖主要含柚皮苷物質和總黃酮，總黃酮對骨質疏松癥導致的骨密度下降有明顯抑制作用[2]。骨碎補總黃酮可以在抑制破骨細胞活性的同時，促進成骨細胞增殖。在近幾年的臨床應用中也證明骨碎補總黃酮對骨質疏松的治療作用療效確切。本實驗所用老鷹翅膀為云南民間習用骨碎補，以下代號：LYCB，觀察LYCB對去卵巢骨質疏松大鼠模型的響，探究其是否具有正品骨碎補防治骨質疏松癥的作用，為其臨床有效性提供實驗依據。

1 材料方法

11 材料 LYCB為石蓮姜槲蕨D propinqua（Wall1）J Smith（四川、廣西）中的老鷹翅膀的提取物，提取率為75%，由云南省藥物研究所天然藥物篩選中心化學組提供；雌性SD大鼠，體質量（300 ±20）g，飼料：SPF大鼠繁殖顆粒飼料，由昆明醫學院實驗動物中心提供，生產許可證：SCXK（滇）2005-0008，SCXK（滇）2005-0009；動物使用許可證：SYXK（滇）2005-0001；戊巴比妥鈉，sigma公司；雌二醇，上海通用藥業股份有限公司，批號100801；鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20110714。AG285型電子分析天平，METTLERTOLEDO公司；多功能彩色病理圖像分析管理系統—ZKPALS，北京北海公司；DXC600全自動生化分析儀，貝克曼公司；PV-200足趾容積測量儀，成都泰盟科技有限公司；YLS-16A小動物骨骼強度儀，淮北正華生物儀器設備有限公司生產。

12 方法

121 實驗分組和造模 除12只大鼠留為空白組外，其余大鼠以04%的戊巴比妥鈉麻醉，固定大鼠，在其最末肋骨下與腹正中線交叉處去毛、消毒切開腹部皮膚、肌肉分別摘除雙側卵巢，縫合切口，抗感染處理；將手術成功的大鼠隨機分為模型組、雌二醇（陽性藥對照）組和LYCB低、中、高劑量組，每組12只。假手術組12只，只做手術切口，不去除卵巢。ig給藥60天，LYCB低、中、高劑量組按01、02、04 g/kg體重劑量給藥，陽性藥組按007 g/kg體重劑量雌二醇給藥，假手術組和模型組給予陽性組等體積的生理鹽水，每3天稱一次體重。

122 指標測定 LYCB治療60 d后，麻醉動物后頸動脈取血，分離血清，用自動生化分析儀測定血清中鈣、磷的含量，堿性磷酸酶（ALP）活性。摘取子宮稱重，計算子宮系數。

取左側股骨稱量質量，計算骨質量系數；將左側股骨采用Archimedes原理，用玻璃容器法將骨浸入PV-200足趾容積測量儀中，測得骨標本的體積V，然后在室溫下，真空干燥至恒重，稱量干重，計算骨密度。將左側測定骨密度后的股骨置烘箱中烤至恒定質量（90 ℃，24 h），測定其質量；在干燥至恒重的馬福爐中灰化（800 ℃，6 h），測定灰質量。取右股骨用YLS-16A小動物骨骼強度儀測定各組骨標本的抗折力。

取右側橈骨，常規固定，脫鈣，切片，HE染色，應用多功能真彩色病理圖像分析儀于100倍下，在干骺端生長板下1～4 mm近皮質處取視野，為測量范圍，進行骨組織形態計量學測定，計算骨小梁個數、平均骨皮質厚度，在高倍鏡視野下觀察多核破骨細胞數及成骨細胞數。

235 數據統計 所有數據采用Excel-2003軟件處理，正態分布的進行t檢驗和相關性分析，所有數值均以（ ±s ）表示。P<005認為有統計學意義。偏態分布資料采用秩和檢驗。

2 結果

21 子宮指數，Ca、P含量及ALP活性變化：結果表明與假手術組比較，模型組子宮指數明顯降低，P 和ALP濃度明顯升高，說明模型組動物堿性磷酸酶分泌增加；陽性組和LYCB低、中、高劑量組與模型組比較，子宮指數和Ca升高，p和堿性磷酸酶含量降低，但無顯著差異。結果見表1

22 骨質量、骨密度、抗折力及骨灰分變化：模型組結果表明與假手術組比較，骨濕重指數、骨密度抗折力指數、骨灰分指數明顯降低，而陽性組和LYCB各劑量組均有不同程度的增高，有的組與模型組比較升高差異顯著，結果見表2。

23 大鼠骨組織形態計量學和骨細胞變化：模型組結果表明與假手術組比較，骨小梁數、骨皮質厚度成骨細胞數明顯降低，破骨細胞數明顯增加；而陽性組和LYCB各劑量組，骨小梁數、骨皮質厚度成骨細胞數均有不同程度升高，破骨細胞數明顯減少。

24 結論：LYCB各劑量組能不同程度升高子宮指數、Ca、骨濕重指數、骨密度抗折力指數、骨灰分指數、骨小梁數、骨皮質厚度和成骨細胞數，P和堿性磷酸酶含量降低，破骨細胞數明顯減少，說明LYCB能明顯降低切除卵巢大鼠的骨丟失，增加骨生成的作用，具有正品骨碎補的抗骨質疏松作用。

3 討論

31 摘除卵巢致大鼠骨質疏松模型的建立 骨質疏松癥是以骨量降低和骨組織顯微結構破壞為特征，導致骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨病[3]。其機制是骨吸收與骨形成作用的失衡，導致骨骼的生理結構發生改變，骨的質量降低而容易發生骨折[4]。骨質疏松癥在絕經后婦女發病率最高，雌激素缺乏是PMOP的首要病因。雌性大鼠的卵巢被切除以后，松質骨的骨量減少，骨代謝活躍，骨強度下降，伴隨骨轉換增強出現松質骨明顯骨丟失，然后部分部位骨丟失速度減慢。這些松質骨骨丟失是伴隨骨轉換增強而進行的，這種特性較好地模仿了人正常絕經時高轉換型骨質疏松發生時的骨丟失狀態。同時，手術后雌性大鼠在骨質疏松性骨折和骨量減少部位上，也表現出與人類很大的相似性。切除卵巢的大鼠經給予合適的雌激素進行替代試驗時并不增加骨轉換和骨喪失。這與絕經后婦女對雌激素替代法的反應相一致[5]。手術摘除大鼠的雙側卵巢（OVX）形成骨質疏松模型，已被公認和采納，經7～12周就可造成模型。本實驗采用摘除卵巢大鼠為模型，能較好的模擬絕經后婦女骨質疏松癥狀。

本實驗采用6月齡雌性大鼠切除卵巢法建立骨質疏松模型[6～7]，從60 d后模型組與假手術組的子宮指數降低，骨密度與骨礦物質含量有顯著性差異，抗折力指數降低，骨灰分指數降低，同時血清中Ca濃度明顯降低，ALP顯著升高，股骨骨小梁數量減少，皮質變薄，成骨細胞數減少，破骨細胞數增多證明骨質疏松造模成功。

32 LYCB對模型大鼠血清ALP、Ca、P含量的影響 血清ALP是常用的評價骨形成和骨轉換的指標。血清中ALP有50%來自于破骨細胞分泌，而另一半絕大部分來源于肝臟。血清ALP活性可反映破骨細胞活躍情況。本實驗結果顯示：LYCB組與模型組比較，血清中ALP有降低趨勢，表明LYCB具有抑制骨吸收，降低骨吸收，提高骨質量的作用。

鈣和磷是人體不可缺少的物質，他們以無機鹽的形式存在于骨組織中。鈣攝入不足是導致骨質疏松的一個重要因素，特別是女性對鈣的攝入量一般要低于男性，而隨年齡增長腸道的鈣吸收能力又明顯減低[8]。本實驗結果顯示：與模型組比較，LYCB高劑量組血清Ca含量顯著升高，而P含量有升高趨勢，表明LYCB能抑制血漿中Ca、P含量的丟失。

33 LYCB對模型大鼠骨密度和骨組織形態學的影響 骨組織強度與骨量有關，還與骨組織結構關系密切[9]。骨量減少是骨質疏松癥的主要病理變化之一，亦是引起骨質疏松骨折的一個主要原因，在臨床及研究中常用骨密度（BMD）表示骨量。本實驗結果顯示：LYCB組與模型組比較，大鼠骨密度有顯著提高，骨灰分指數增高。大鼠骨小梁數目增多，骨皮質厚度增加，表明LYCB能有效抑制摘除卵巢導致的骨礦物質丟失和骨組織顯微結構的改變，抑制骨密度和骨質量的降低，增加機體骨的機械強度。

34 LYCB對模型大鼠骨力學的影響 骨質疏松后，骨的結構和材料力學性能參數均有不同程度的下降，骨抵抗外力的能力降低[10]。而一種藥物對骨質疏松的治療效果也可通過用藥前后骨的力學性能變化情況，最直觀的表現出來，即力學性能參數是反映和評價骨質量的最直接的指標。本實驗結果顯示：空白組與模型組比較，模型組骨生物力學參數顯著降低，這與臨床骨質疏松容易導致骨折的情況吻合，而LYCB組骨生物力學參數顯著提高，表明LYCB能防止骨韌性、降低骨脆性增加，從而減少大鼠骨折的發生率，增強抵抗外力沖擊能力。

35 LYCB對模型大鼠骨細胞的影響 成骨細胞是參與骨代謝的重要細胞，它與破骨細胞共同維持著骨代謝重建的平衡。在骨代謝的過程中，破骨細胞在骨吸收過程中起著主要的作用，舊骨被吸收的速度和持續時間取決于破骨細胞的骨吸收活性和破骨細胞的數量。如果破骨細胞的骨吸收活性降低，則骨吸收的范圍減少；反之，則吸收的范圍增大。骨質疏松發生的機理是骨吸收大于骨形成，在骨的重建過程中無法完全修復被吸收的骨質，使其骨量不斷減少，骨質下降。因此，治療骨質疏松的關鍵是促進成骨細胞的成骨過程，緩解破骨細胞的破骨過程[11]。本實驗結果顯示：LYCB組與模型組比較，模型組成骨細胞數顯著減少，破骨細胞數顯著增多，而LYCB組成骨細胞數顯著增多，破骨細胞數顯著減少，表明LYCB能促進成骨細胞的增多，抑制破骨細胞的增加，從而促進骨形成，抑制骨吸收。

綜上所述，LYCB能有效抑制摘除卵巢所致骨質疏松模型大鼠的骨質丟失，抑制骨吸收，促進骨形成，改善骨代謝的負平衡狀態，與正品骨碎補一樣對摘除卵巢導致的骨質疏松癥具有良好的防治作用，但對于減少骨質丟失的作用機理還不明確，有待進一步研究。

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