兔急性房顫時心房肌鈣通道α1C、β1及鉀通道Ikr的表達和藥物干預

鄧貴智 胡建新

[摘要] 目的 通過建立兔急性房顫的模型觀察伊布利特、參松養心膠囊及兩藥聯合用藥對兔心房肌L型鈣離子通道α1C、β1和鉀離子通道Ikr表達的影響。 方法 通過建立兔急性房顫模型，應用RT-PCR、Western blot檢測正常組、刺激組、伊布利特組、參松養心膠囊組和聯合用藥組心房肌α1C、β1 、IKr基因和蛋白表達水平，并進行統計學分析。結果 （1）與正常組比較，刺激組L型鈣離子通道α1C基因與蛋白表達及β1基因表達顯著降低（P<0.01）；而Ikr基因及蛋白表達無明顯變化（P>0.05 ）。（2）與刺激組比較，伊布利特組α1C基因與蛋白表達及β1基因表達高于刺激組（P <0.01），Ikr基因及蛋白表達低于刺激組（P<0.01）；參松養心膠囊組α1C基因與蛋白表達及β1基因表達水平與刺激組無明顯差異（P>0.05），Ikr基因及蛋白表達水平無明顯差異（P>0.05）；聯合用藥組α1C基因與蛋白表達及β1基因表達高于刺激組（P <0.01），IKr 基因及蛋白表達低于刺激組（P <0.01）。（3）與伊布利特組比較，伊布利特與參松養心膠囊聯合用藥組α1C基因與蛋白表達及β1基因表達水平無顯著差異（P >0.05）；Ikr基因及蛋白表達水平無顯著差異（P >0.05）；參松養心膠囊組α1C基因與蛋白表達及β1基因表達水平低于伊布利特組（P <0.01），Ikr基因及蛋白表達水平高于伊布利特組（P <0.01）。（4）參松養心膠囊組α1C基因與蛋白表達及β1基因表達水平低于聯合用藥組（P <0.01），Ikr基因及蛋白表達水平高于聯合用藥組（P <0.01）。 結論 （1）房顫誘發術后刺激組兔心房肌L型鈣離子通道α1C、β1 表達明顯下降，而IKr表達無明顯變化。（2）伊布利特可抑制L型鈣離子通道α1C、β1 表達下降及降低鉀離子通道IKr表達。參松養心膠囊對不能抑制L型鈣離子通道α1C、β1表達下降，對鉀離子通道Ikr的表達無明顯影響。（3）聯合用藥對比單用伊布利特對α1C、β1、IKr的表達無明顯影響。

[關鍵詞] 急性房顫；L型鈣離子通道；鉀離子通道

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）05-30-05

心房顫動（AF），簡稱房顫，是最常見的心律失常之一，全球約有3%～5%人群發生房顫。房顫的機制目前尚不明確，房顫發生時，心房肌細胞離子通道會發生一系列的改變，從而產生電重構，主要表現為動作電位時程（APD）、心房有效不應期（AERP）的縮短，不應期離散度增大、不應期頻率適應性下降以及傳導速度減慢。Bosch等[1]研究表明，房顫發生時，心肌內有多種離子流的改變，特別是L型鈣離子流及鉀離子流的改變，兩者可能是導致心肌電重構的主要原因。本實驗研究擬探討伊布利特、參松養心膠囊及伊布利特與參松養心膠囊聯合應用對房顫的預防作用，及其對房顫誘發實驗中兔心肌α1C、β1、IKr表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

60只日本大耳兔隨機分正常組、刺激組[生理鹽水5 mL/（kg·d）灌胃]、伊布利特組[伊布利特（安徽豐原藥業股份有限公司，H20061029）0.1 mg/（kg·d）耳緣靜脈推注]、參松養心膠囊組[參松養心膠囊（石家莊以嶺藥業股份有限公司，Z20103032]0.2 g/（kg·d）灌胃]、伊布利特與參松養心膠囊聯合應用組，簡稱聯合用藥組[耳緣靜脈推注伊布利特0.1 mg/（kg·d）及參松養心膠囊0.2 g/（kg·d）灌胃]。均在誘發房顫實驗前用藥4周。除正常組外，其余各組均于用藥后4周進行房顫誘發試驗。

1.2 方法與步驟

1.2.1 房顫誘發 3%戊巴比妥1 mL/kg經兔耳緣靜脈麻醉，頸部及左胸前區予NaS2脫毛備皮，行頸部氣管切開，氣管插管，動物呼吸機輔助呼吸（呼吸頻率34～60次/min，潮氣量25～30 mL，吸/呼比3/1），同步記錄體表心電圖。胸骨正中開胸，逐層切開胸壁組織，分離出第3、4根肋骨，小心離斷（注意勿傷及肋間動脈），剪開胸膜，暴露心臟，剪開并懸吊心包，充分暴露左心房，予自制電極一根固定于左心耳（電極頭端處可導電，其余處均不能導電），另一根電極固定于胸大肌。連接心電生理刺激儀，進行程序期前刺激與Burst刺激相結合的方法誘發房顫，觀察心電圖，出現“丁”字形起搏信號表示刺激有效。多功能心電刺激儀設定：脈寬2 mv，輸出電壓為2倍舒張期閾值，S1/S2為8/1，步長-10 ms。S1S2固定于心房有效不應期，引入第二個早搏刺激S3時加30 ms，S2S3從基礎周長的80%開始，以10 ms步長反掃至S3落入不應期。以同樣的方法引入第三個早搏刺激S4直至誘發出房顫。上述方案不能誘發，則以周長為100 ms的Brust刺激進行誘發。如均不能誘發，則房顫誘發不成功。刺激組、伊布利特組、參松養心膠囊組、聯合用藥組房顫誘發條件相同。

1.2.2 標本采集 每組家兔于刺激結束后在麻醉狀態下取下心臟，用生理鹽水沖洗干凈，取少許左心耳組織放入液氮冷凍保存，以備提取組織RNA及蛋白。

1.2.3 RNA的提取與R-t PCR 取80 mg左心耳組織剪碎勻漿，采用Catrimox-Guanidinium一步法提取總RNA，提取物以40μL DEPC水溶解，采用紫外分光度儀測定溶度備用。逆轉錄-聚合酶鏈式反應：RNA變性，逆轉錄合成cDNA，以GAPDH為內參照，在同一反應體系中行PCR。L型鈣通道α1C亞基正義鏈：5-CTGGACAAGAACCAGCGACAGTGCG-3 ，反義鏈：50-ATCACGATCAGGAGGGCCACATAGGG-3。β1亞基正義鏈：5-AGCTTGCGCTGAGTTCTTGC-3，反義鏈：5-TCCCTTGCTTTGCTCTCTG-3。IKr正義鏈：5-TCGCACCATTAGCAAGATTC-3，反義鏈：5-GGATGAGCCAGTCCCACA-3。GAPDH正義鏈：5-GCTTTTAACTCTGGCAAAGTG-3，反義鏈：5-GATGATGACCCTTTTGGCTC-3。曲4μL PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，120 V，100 mA，30 min，溴化乙錠染色，凝膠成像儀成像，用SnyGene凝膠成像分析系統，根據條帶灰度和寬度自動分析。

1.2.4 蛋白質的提取與Western blot 取100 mg組織放入研缽剪碎研磨（在冰上進行），加入蛋白提取液300μL、10%蛋白抑制劑30μL繼續研磨，吸取提取液冰浴放置30 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min，吸取上清，按Bradford比色法測定蛋白濃度，加loading buffer煮沸5～10 min。聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白質，半干式電轉膜90 min，5%脫脂牛奶的TBST封閉液，室溫1 h，分別加α1C、Ikr單克隆抗體4℃封閉過夜，加入含有1∶2000稀釋辣根酶標記的相應二抗工作液，室溫下孵育1 h，X光片曝光顯影，用Sicon Image軟件對Western blot條帶進行灰度分析，按：蛋白相對含量=該蛋白條帶的灰度值/上樣對照條帶的灰度值公式計算蛋白相對含量。

1.3 統計學處理

用SPSS17.0統計軟件進行分析，所有計量資料以（）表示，檢驗2個或2個以上樣本率用x2檢驗，多組間均數比較用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 刺激組、伊布利特組、參松養心膠囊組、聯合用藥組房顫誘發情況

聯合用藥組、伊布利特組兩組房顫誘發率明顯低于刺激組（分別為x2=5.48，P=0.01；x2=4.84，P=0.02），伊布利特組與聯合用藥組比較無統計學差異（x2=2.12，P=0.34）。參松養心膠囊組與刺激組比較，差異無統計學意義（x2=0.68，

2.2 α1C、β1、IKr基因表達水平

聯合用藥組、伊布利特組、參松養心膠囊組、刺激組L型鈣離子通道α1C、β1基因表達水平均低于正常組（t=6.47，P<0.01）。伊布利特組α1C、β1基因表達水平高于刺激組（t=5.86，P<0.01），伊布利特組α1C、β1基因表達水平高于參松養心膠囊組（t=8.26，P<0.01）；伊布利特組與聯合用藥組比較α1C、β1基因表達水平無明顯差異（t=1.37，P>0.05）。參松養心膠囊組α1C、β1基因表達水平與刺激組比較無明顯差異（t=1.61，P>0.05）。聯合用藥組α1C、β1基因表達水平高于參松養心膠囊組（t=3.68，P<0.05）。見表2。α1C、β1、IKr基因表達見圖3、4、6。

2.3 α1C、IKr蛋白表達水平

聯合用藥組、伊布利特組、參松養心膠囊組、刺激組L型鈣離子通道α1C、蛋白表達水平均低于正常組（t=3.18，P<0.05），伊布利特組α1C蛋白表達水平高于刺激組（t=6.21，P<0.01），伊布利特組α1C蛋白表達水平高于參松養心膠囊組（t=7.56，P<0.01）；伊布利特組與聯合用藥組比較α1C蛋白表達水平無明顯差異（t=2.01，P>0.05）。參松養心膠囊組α1C蛋白表達水平與刺激組比較無明顯差異（t=3.67，P>0.05）。聯合用藥組α1C、β1基因表達水平高于參松養心膠囊組（t=3.68，P<0.05）。見表3。α1C、IKr蛋白表達見圖5、6。

3 討論

3.1 經房顫誘發實驗后L型鈣離子通道α1C、β1的表達

眾多研究表明房顫可引起L型鈣離子通道α1C基因及蛋白表達下降，Ca2+內流減少，動作電位及有效不應期縮短[2-3]，Bosch等[1]研究亦發現房顫患者中β1亞基比竇性心律者表達降低，并指出在房顫患者及動物模型中，L型鈣離子流密度明顯下降，α1C，β1亞基及蛋白表達水平較竇性心律者降低。本研究結果表明，在兔急性房顫誘發實驗中，經對兔心房刺激后，刺激組L型鈣離子通道α1C、β1基因及蛋白表達水平明顯低于正常組（P<0.01），提示心房經過快速起搏時，L型鈣離子通道活性降低。心肌細胞保持細胞內Ca2+離子平衡主要通過電壓依賴方式和鈣依賴方式使鈣離子通道失活（CDI）[4]，當心房經過快速起搏時，進入細胞內Ca2增多，并誘發肌漿網釋放更多Ca2+，使細胞Ca2+內異常升高，觸發CDI，使LVDCC活性降低，L型鈣離子通道電流密度下降，這是α1C、β1基因及蛋白表達下降的可能機制。LVDCC活性降低，Ca2+內流減少，平臺期Ca2+降低，動作電位時程及心房有效不應期進行性縮短，心房傳導離散度增加，不應期頻率適應性降低[5-6]，從而有利于房顫的發生和維持。因此，在房顫的形成過程中，α1C、β1亞基表達下降，L型鈣離子通道活性降低，動作電位時程、心房有效不應期縮短等都起著重要的作用。推測通過藥物干預使L型鈣離子通道活性升高，平臺期Ca2+增多，適當延長動作電位時程及心房有效不應期，可以預防及減少房顫的發生，降低房顫的發生率。

3.2 經房顫誘發實驗后Ikr的表達

房顫時，動作電位時程及心房有效不應期進行性縮短，復極加速是其重要原因。在心肌的復極過程中，有多種離子流的參與，其中延遲整流鉀通道（IK）在心肌的復極過程中起著關鍵作用。心肌細胞上的延遲整流鉀離子通道包括三種鉀電流：快激活延遲整流鉀電流（IKr）和慢激活延遲整流鉀電流（IKs），以及超快激活延遲整流鉀電流（IKu），其中以延遲整流鉀電流（IKr）最為重要[7]。IKr編碼基因是HERG，其變異可致遺傳性長QT綜合征[8-9]，EHRG表達增高，可使快激活延遲整流鉀電流增加，復極時間減少，動作電位時程及心房有效不應期縮短。Manios等[10]研究也表明IKr通道基因表達升高，可以使心肌細胞動作電位2、3相外向鉀離子流增加，使心肌復極加快，動作電位時程及有效不應期縮短。但Yue等[11]在對犬房顫誘發實驗中發現，在經快速起搏的犬心房及已成功誘發房顫的犬心房中，IKr表達與對照組比較并無差異。

本實驗結果表明，在經快速起搏的兔心房中，刺激組Ikr通道基因及蛋白表達水平與正常組比較無明顯差異，與Yue等實驗結果一致。因此，本研究認為在房顫的發生過程中，心房快心率時IKr通道基因及蛋白不會升高，IKr可能沒有參與心房的電重構，房顫發生時，APD及ERP縮短可能由L型鈣通道及其他離子通道功能失調所致。IKr通道基因表達異常升高，可以使細胞動作電位2、3相外向鉀離子流增加，復極加快，動作電位時程及有效不應期縮短，可能有利于房顫的發生及維持，Li等[12]研究發現犬左房HERG蛋白表達高于右房，同時觀察到犬左房動作電位時程及心房有效不應期短于右房，考慮左心房IKr通道基因高表達是左心房好發房顫的因素之一，但在房顫發生的過程中，IKr基因及蛋白表達并無明顯變化。因此，可以推測應用藥物干預使心房IKr通道基因表達適當下降，可以減少房顫的發生。Lai等[13]發現，在慢性房顫患者中，IKr通道基因表達水平低于竇性心律者，其表達水平降低可能是對長期房顫時縮短的動作電位時程及心房有效不應期的一個自身的反饋調節，從而減輕房顫后心房的電重構，是一種保護機制。

3.3 經房顫誘發實驗后伊布利特、參松養心膠囊干預的效果

本實驗表明伊布利特可以抑制兔心房快速起搏時L型鈣離子通道α1C、β1表達的下降。α1C、β1是LVDCC主要功能亞基，α1C、β1表達的降低，可使L型鈣通道活性降低，L型鈣電流（ICa-L）密度下降，Ca2+內流減少，心肌細胞動作2相平臺期縮短，APD及ERP縮短，ERP頻率適應性降低，有利于折返的形成，使房顫得以發生及維持。伊布利特能夠抑制α1C、β1表達下降，促進Ca2+內流，有效延長APD及ERP，從而不利于心律失常的發生，可能是其具有預防兔急性房顫發生作用的機制之一。本研究實驗表明，伊布利特可以降低鉀離子通道IKr基因及蛋白的表達。IKr是細胞復極的主要離子流，與Na+和Ca2+內流的相對速率決定平臺期的長短。IKr通道基因的高表達，可以使心肌細胞復極時外向鉀離子流增加，使復極加快，APD及ERP縮短。伊布利特可以降低IKr通道基因的表達，使復極時外向鉀離子流減少，可以使復極時間延長APD及ERP，從而不利于房顫的發生及維持。因此，心臟瓣膜術后等房顫高發人群中，應用伊布利特可能能起到很好的預防作用。伊布利特其副作用可過度延長有效不應期及QT間期，部分患者可致尖端扭轉型室速（Tpd）[14-15]，有報道伊布利特致Tpd發生率為4.3%，可能與其使鈣離子內流增多，過度阻滯IKr，易誘發早期后除極有關。

該實驗發現參松養心膠囊組兔急性房顫誘發率41.7%明顯低于刺激組75.0%，但可能由于樣本數量偏少，差異無統計學意義，其對房顫的發生可能有一定的影響，有待于進一步的研究。本研究發現參松養心膠囊組α1C、β1的表達與刺激無明顯差異（P>0.05），但低于正常組（P<0.01）。提示參松養心膠囊不能抑制心房快速起搏時α1C、β1表達的下降，也不能使心房快速起搏時已表達下降的α1C、β1表達進一步下降。因為在心房快速起搏時，L型鈣離子通道活性下降，α1C、β1的表達已有降低，所以尚不能提示其對鈣離子通道是否有阻滯作用。伊布利特與參松養心膠囊聯合用藥組與伊布利特組無明顯差異（P>0.05），提示參松養心膠囊不能協同伊布利特抑制α1C、β1表達的下降，也不能使伊布利特抑制α1C、β1表達的下降作用降低。李寧等[16]研究發現參松養心膠囊提取干粉對正常心肌細胞INa、ICa-L有阻滯作用，因此可以推測，參松養心膠囊對正常的L型鈣離子通道可能具有阻滯作用，但對房顫發生時活性已降低的L型鈣離子通道影響有限。

本實驗表明參松養心膠囊組IKr表達與正常組、刺激組無明差異（P>0.05），提示參松養心膠囊對兔心房肌IKr表達沒有影響。聯合用藥組IKr表達與伊布利特組無明顯差異，提示參松養心膠囊不能影響伊布利特對IKr的阻滯作用。

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（收稿日期：2013-01-31）